棉花根茎叶中黄酮类化合物的超声提取及含量测定.doc

1、棉花根茎叶中黄酮类化合物的超声提取及含量测定作者：马彦梅 李炳奇 廉宜君，刘红【摘要】 目的寻找在超声条件下从棉花根、茎、叶中提取黄酮的优化条件，并测定与比较植株不同部位黄酮类化合物的含量。方法提取采用正交设计法，以乙醇浓度、提取次数、提取温度及固液比为因素，每个因素 3 个水平进行正交设计；用紫外分光光度法测定黄酮含量。结果最佳提取条件为：乙醇浓度 60%，超声温度 25，固液比 110，提取3 次。黄酮含量分别为：叶 0.494%，茎 0.398%，主根 0.268%，侧根0.257%，叶柄 0.289%。结论棉花植株中黄酮类化合物的含量由高到低依次为：叶，茎，主根，侧根，叶柄。 【关键词

2、】 棉花 黄酮类化合物 超声提取Abstract：ObjectiveTo ascertain optimum ultrasonic extraction technology condition for flavonoids from the root,stem and leaf of cotton , and determine and compare the concent of flavonoids of different parts of cotton.MethodsOrthogonal design was used to investigate four factors (eth

3、anol concentration,extraction times, extraction temperature, material and solvent ratio)at three levels respectively,and determine the content of flavonoids by ultroviolet spectrophotometry.ResultsThe optimum extraction conditions were 60% ethanol extracting with material and solvent ratio 110 for 2

4、5 ultrasonic extraction for 3 times.The content of flavonoid were leaf 0.494%,stem 0.398%,taproot 0.268%,lateral root 0.257%,petiole 0.289%.ConclusionThe order of the content of flavonoids of different parts of cotton is leafstemtaprootlateral rootpetiole.Key words：Cotton; Flavonoids; Ultrasonic ext

5、raction; Content determination 在生态系统中，农业环境日益恶化是一个严峻事实，造成这种状况的原因虽是一个涉及面极为广泛的问题，但其重要原因之一是长期、大量的使用化学杀虫剂而产生了“农药公害” 。植物源杀虫剂具有对害虫高效、无残毒，不污染农业生态环境和农产品，对非靶标生物无明显影响等特点。棉花的根、茎、叶中存在的黄酮类化合物,有着重要的抗病虫害作用。在我国的棉花抗虫（病）性基础研究中，棉花黄酮一直是备受注目的次生代谢产物，它们具有对有害生物抗生性、阻食性、抗孢子和酶抑制性的作用1 ，是一类具有很大潜力的抗虫（病）物质。新疆是我国最大的产棉区，年产量一直保持在 150

6、 万吨左右，占全国棉花总产量的 1/3，棉杆、叶资源每年达 600750 万吨2 。为了充分利用新疆这一宝贵资源，笔者对棉花根、茎、叶中的黄酮类化合物进行了提取和含量测定，以便为后续研究打下良好的基础。1 仪器与材料1.1 仪器 Spectrumlab54 紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司） ；HF-2.5B 超声循环提取机（北京弘祥降生物技术开发有限公司） ；电子天平（北京赛多利斯天平有限公司） ；TDL-5 台式离心机(上海安亭仪器厂)。1.2 试剂和材料乙醇、甲醇、氢氧化钠、浓硫酸、苯酚(5%)、盐酸、氢氧化钾(10%)、氢氧化钠(均为分析纯)。棉花根、茎、叶等。(取自石河子大学

7、农学院试验场)。2 方法2.1 黄酮含量测定方法本研究以芦丁为标准品，用紫外分光光度计测定黄酮含量。标准曲线的绘制：精密称取 120干燥至恒重的芦丁标准品适量，加水溶解，转移至 100 ml 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀（每毫升含芦丁 0.2 mg） ，精密吸取此溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置于 25ml 容量瓶中，各加 60%乙醇至 10 ml，分别加入 5%NaNO2 溶液 0.3 ml,放置 6 min，然后加入 10%Al(NO3) 3 溶液 0.3ml，混匀，再放置 6 min，加入 4%NaOH 溶液 4 ml，用水稀释至刻度，混匀，放置

8、 15 min，在分光光度计上扫描波长从 400600 nm 之间的吸收度, 在 510 nm波长处有最大吸收值,以吸光度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标做标准曲线，数据经回归处理，计算得回归方程：y=12.384x-0.0004，r=0.999。2.2 单因素实验2.2.1 乙醇浓度取棉花茎 4 g，50 ml 30% 乙醇为溶剂， 25下超声提取两次，30 min/次。再在相同条件下分别以40%,50%,60%,70%,80%,90%乙醇为溶剂提取。过滤，滤液分别用紫外分光光度计测定吸光度,并计算出黄酮类化合物含量。2.2.2 超声温度取棉花茎 4 g，30% 乙醇 50 ml，分别在25，

9、35，45下超声提取。过滤，滤液分别用紫外分光光度计测定吸光度,并计算出黄酮类化合物的含量。2.2.3 超声次数超声次数不同提取效果不同。实验发现超声次数太多，浪费溶剂，提高成本；超声次数太少，不能充分提取出有效成分。根据实验具体情况，选定超声次数为 1，2，3 次进行正交实验。2.2.4 固液比固液比不同提取效果不同。实验发现固液比太小，影响超声提取器的循环和搅拌；固液比太大，浪费溶剂。在综合分析的基础上 ，选定固液比为 18，110 和 112 进行正交实验。2.3 正交实验在对以上单因子因素分析和实验的基础上，对影响棉花黄酮提取效果的乙醇浓度、超声温度、固液比、提取次数等 4 个因素，每

10、个因素 3 个水平（见表 3） ，用 L9（34）进行正交实验设计。2.4 棉花叶侧根主根叶柄中黄酮类化合物的含量分别取棉花叶侧根主根叶柄各 4g，在相同条件下提取。分别用紫外分光光度计测定其吸光度,计算黄酮类化合物的含量。3 结果3.1 单因素实验结果3.1.1 乙醇浓度对提取效果的影响见表 1。从表 1 可以看出，60%的乙醇做溶剂时提取效果最好，因此选择乙醇浓度为 60%左右时进行正交实验。表 1 乙醇浓度对提取效果的影响（略）3.1.2 超声温度对提取效果的影响见表 2。从表 2 可以看出，超声温度为 35时黄酮的含量最高，35后开始降低，因此选择 35左右进行正交实验。表 2 超声温

11、度与含量的关系（略）3.2 正交实验设计结果见表 3。表 3 L9（34）正交设计及结果（略）实验结果表明，黄酮的最佳提取条件为 A2B2C2D3，即乙醇浓度 60%，超声温度 35，固液比 110，提取次数 3 次。根据极差分析结果,影响黄酮提取效果的因素大小为:浓度次数温度固液比。该提取工艺影响因素最大的是乙醇浓度，最小的是固液比。3.3 验证实验结果取棉花茎 4 g，60%乙醇溶剂 40 ml。根据筛选得到的最佳提取条件平行提取 3 次。分别测定棉花黄酮的含量。结果见表 4。表 4 验证实验结果（略）验证实验证实，根据最佳提取条件提取的黄酮含量均大于正交设计中的含量，所得的结果正确。3.

12、4 棉花叶侧根主根叶柄中黄酮类化合物的含量测定结果见表 5。表 5 棉花其他部分的黄酮含量（略）4 结论棉花黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度 60%，超声温度 35，固液比 110，提取次数 3 次。棉花植株中黄酮类化合物的含量由高到低依次为：叶，茎，主根，侧根，叶柄。以芦丁为标准品，用紫外分光光度法分别测得其含量是叶0.494%，茎 0.398%，主根 0.268%，侧根 0.257%，叶柄 0.289%。超声辅助法提取棉花植株中的黄酮，不仅操作过程简单，提取时间短，而且提取效果好，对成分破坏性小,是一种高效的提取方法。【参考文献】1 武予清，郭予元.棉花单宁和黄酮类化合物研究概况J.中国棉花,2000,27(8):47.2 新疆生产建设兵团史志编篡委员会.新疆生产建设兵团年鉴,第 1 版M.新疆:新疆生产建设兵团年鉴社,2005:176.