凝胶渗透色谱净化气相色谱质谱法同时测定金银花中33种农药残留组分.doc

1、凝胶渗透色谱净化 气相色谱 质谱法同时测定金银花中 33 种农药残留组分作者：庄婉娥 弓振斌 叶江雷 陈登云【摘要】 建立了凝胶渗透色谱（GPC）净化、气相色谱 质谱（GCMS ）同时测定金银花中 33 种有机氯、有机磷和拟除虫菊酯农药残留的方法。样品中的待测农药组分经乙酸乙酯 环己烷混合溶剂（11， V/V）提取、GPC 净化去除色素等杂质，GCMS 采用全扫描/选择离子监测模式（Scan/SIM）采集数据后进行定性/定量分析。方法的相对标准偏差（RSD）16.70 %（6.984.6 ng/g，n=5） ；5 种不同加标浓度下，待测农药的标准加入回收率在 57.4%（甲胺磷）109.9%（

2、马拉硫磷）之间；各农药组分的定性检出限（3）为 0.1010.5 ng/g，定量检出限（10 ）为 0.3320.0 ng/g。 【关键词】 金银花； 凝胶渗透色谱； 气相色谱 质谱； 农药残留Abstract A method was developed for the simultaneous determination of 33 pesticide residues, including organochlorine, organophosphorus and pyrethroid pesticide, in honeysuckle by gel permeation chromato

3、graphy(GPC) purification and gas chromatographymass spectrometry(GCMS) detection. The pesticides were extracted using mixed solvent of ethylacetate and cyclohexane(11, V/V). The pesticides extracted from sample were separated and purified with matrices such as pigment by gel permeation chromatograph

4、y. The pesticides were finally separated and detected by GCMS with full scan and selective ion monitor mode simultaneously. The precisions of developed method with relative standard deviation for 33 pesticide were lower than 16.7%(6.984.6 ng/g, n=5). The recoveries for 33 pesticide standards spiked

5、samples were between 57.4%(methamidophos) and 109.9%(malathion). Limits of detection(3) and quantifications(10) of the method were 0.1010.5 ng/g and 0.3320.0 ng/g, respectively.Keywords Honeysuckle; Gel permeation chromatography; Gas chromatographymass spectrometry; Multipesticide residues1 引 言中药安全问

6、题，如中药中的有害成分1、重金属污染2,3、农药残留4,5等已引起广泛关注6,7。有关中药中农药残留测定方法的研究已有许多报道4,5,810，但涉及的农药品种较单一，多数仅局限于 2000 年“中国药典”规定的六六六、滴滴涕和五氯硝基苯，同时测定中药中有机氯、有机磷和拟除虫菊酯农药的方法尚未见报道。已报道的中药中农药残留检测方法中，多数采用固相萃取（SPE）净化和气相色谱（GC）测定1113。与传统的 SPE 相比，凝胶渗透色谱（GPC）净化具有自动化程度高、重现性好等优点，适合于中药材、生物等复杂基质中农药残留测定的净化过程。气相色谱 质谱（GCMS ）不仅能准确定量，而且能定性确证目标组分

7、 ，避免了 GC 测定造成的误判和假阳性结果。金银花为传统中草药，具有清热解毒功效，用量多，用途广，严格控制农药残留量显得尤为重要1。本研究结合凝胶渗透色谱和气相色谱 质谱技术，建立了同时测定中药材金银花中 33 种有机氯、有机磷和拟除虫菊酯农药残留的方法。GPC 将待测目标农药与样品基质中的大分子物质（如色素等）分离11，达到分离、净化农药组分的目的；GCMS 则根据保留时间和特征离子丰度比进行双重定性，避免误判，SIM模式提高测定的灵敏度和选择性，达到准确定量的目的。2 实验部分2.1 仪器与试剂7890A5975C 气相色谱 质谱联用仪（美国 Agilent 公司） ， 配备自动进样器和

8、化学工作站； LC Tech 全自动凝胶渗透色谱仪， Bio Beads SX3 凝胶净化柱（ 40 0mm25 mm(3875) m） ； EVA自动浓缩仪（德国 LC 公司） ； B5200SOT 超声波清洗仪（美国 Branson 公司）； MS2 微型旋涡混匀器（德国 IKA 公司） ； 04121 离心机（上海手术器械厂） ；实验室自制氮吹浓缩装置。丙酮、乙酸乙酯和环己烷(色谱纯, 美国 Fisher 公司）; 33 种农药标准(购于国家标准物质研究中心)。2.2 样品预处理将金银花样品磨碎，过孔径 380 m 的筛后准确称取 1.0000 g 于15 mL 聚乙烯离心管中，加入 5

9、 mL 乙酸乙酯 环己烷（11， V/V）混合提取剂，混匀，超声波提取 10 min 后， 3000 r/min 离心 3 min，取上清液；重复上述操作两次，合并 3 次提取液，氮吹浓缩至 10 mL；0.2 m 滤膜过滤后取 5 mL 通过 GPC 进行净化，乙酸乙酯 环己烷（11， V/V）为流动相，流速 5 mL/min，收集 1736 min 流出物 95 mL，用 EVA 自动浓缩仪浓缩至 5 mL，乙酸乙酯 环己烷（11， V/V）定容至0.5 mL，供 GCMS 测定。2.3 色谱 质谱条件DB5 ms 毛细管柱（ 30 m250 m， 0.25 m） ，载气为高纯氦气（纯度9

10、9.999%） ；进样口温度 250 ，恒压模式，不分流进样，进样量 1L；以甲基毒死蜱作保留时间锁定。色谱柱初始温度 50，保持1 min，以 25 /min 升至 125 ，再以 10 /min 升至 300，保持 10 min。电子轰击源（EI） ，70 eV；离子源温度 230 ；四极杆温度 150 ；接口温度 280 ；溶剂延迟 3.5 min； 测定模式为全扫描/选择离子监测（Scan/SIM）同时采集模式，表 1 为 SIM 模式下的离子分组。表 1 SIM 离子分组（略）3 结果与讨论3.1 多种农药的定性分析各目标农药的保留时间、特征离子及其相对丰度列于表 2。TIon， Q

11、1， Q2 和 Q3 为各农药对应的特征离子，其中 TIon 为定量离子，R1，R2和 R3 分别为特征离子 Q1， Q2 和 Q3 与定量离子 TIon 的丰度比值，即特征离子 Q1， Q2 和 Q3 的相对丰度。图 1 为 33 种农药混合标准的总离子流图（TIC） 。实验中首先通过保留时间对样品中 33 种农药残留进行定性，表 2(The peak number is the same as in Table 2).再通过比对样品中各农药特征离子的相对丰度与标准溶液中对应农药特征离子的相对丰度，对目标农药进行进一步确证。3.2 提取和净化条件的优化在金银花样品基质中，加入适量的 33 种

12、农药混合标准溶液，振荡混匀后在4 冰箱中放置 4 h，按 2.2 和 2.3 节的操作流程进行样品处理及测定。比较乙腈、乙酸乙酯和不同比例的乙酸乙酯 环己烷（31和 11，V/V）：各农药的预计保留时间(Expectant retention time for pesticides)。的提取效果。实验结果表明，乙酸乙酯 环己烷（11， V/V）不仅能有效地提取 33 种农药，同时也减小了基质共提取物对目标农药定性/定量测定的干扰。此外，乙酸乙酯 环己烷（11， V/V）与 GPC 流动相一致，因而选择乙酸乙酯 环己烷（11， V/V）为农药目标物的提取剂。表 2 33 种农药的保留时间、特征离

13、子及其相对丰度（略）通过分时段收集 GPC 的流出物，发现 33 种农药主要在 1636 min流出，但 1617 min 的流出物仍含有较多色素。为避免色素对目标物测定的干扰，最终选取 1736 min 为流分收集时间。实验结果表明： 1736 min 之间的流出物既能保证各农药有较高的回收率，又可避免色素等杂质的干扰，可达到待测组分 GPC 净化的目的。3.3 方法精密度以人工合成样品进行方法精密度实验。准确称取 5 份各 1.0000 g金银花样品，分别加入相同量的农药混合标准溶液，振荡混合均匀后在4 冰箱中放置 4 h，制备成含适量农药的人工合成样品；然后按照 2.2和 2.3 节进行

14、目标物提取、净化和测定。33 种农药在添加标准浓度在6.9（毒虫畏 E）84 ng/g（毒虫畏）范围内的相对标准偏差为5.9%（马拉硫磷）14%（氯氰菊酯 ）范围内，各种农药的添加标准浓度，测得的标准偏差、相对标准偏差和定量检测下限详见附表(http:/ 16.7%。3.4 方法的准确度以标准加入回收实验的回收率来验证方法的准确度。准确称取 5份各 1.0000 g 金银花样品，分别在 5 份样品中加入表 4 所列浓度的农药混合标准溶液，振荡混合均匀后在4 冰箱中放置 4 h，制备成含适量农药的人工合成样品；然后按照 2.2 和 2.3 节进行目标物提取、净化和测定，计算各组分的回收率。以各农

15、药组分的定量离子峰面积对添加农药标准浓度作图，用线性回归的方法对测得的峰面积和标准加入农药浓度进行回归，求得线性回归方程和相关系数。表列出了 33 种农药在 5个不同加标浓度下的回收率、线性回归方程和相关系数。结果显示，5 种不同加标浓度下，除甲胺磷（57.4%）和敌敌畏（66.0%）外，其它待测农药的标准加入回收率在 72.3%（六氯苯）109.9%（马拉硫磷）之间，线性相关系数 r0.9855，说明本方法在各组分所添加的浓度范围内，各组分的回收率是稳定的。表 33 种农药的加标加入回收结果（略）3.5 方法检出限以 3 倍信噪比(S/N)计算 33 种农药的定性检出限（LOD）, 10 倍

16、信噪比计算定量检出限（LOQ） 。33 种农药的检出限列于表 3。33 种农药的定性检出限为 0.1010.5 ng/g，定量检出限为 0.3320.0 ng/g。 结果表明，本方法自动化程度高、选择性较好、检出限低，具有稳定的回收率和较小的相对标准偏差，可满足典型中药金银花中多种农药残留测定的要求。【参考文献】1 Draar P, Moravcova J. J. Chromatogr. B, 2004, 812(12): 3212 Huang R J, Zhuang Z X, Tai Y, Huang R F , Wang X R, Lee F S C. Talanta, 2006, 68(

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