三种检测AmpC酶方法的比较.doc

1、三种检测 AmpC 酶方法的比较作者：陈林珍，李晓穗，刘一鸣，邹燕 【关键词】 表型筛选法 摘要:目的 采用三维试验、表型筛选法及头孢西丁纸片药敏法(K-B法)同时检测肠道 G-杆菌的 AmpC 酶，并加以比较，找出一种适合临床常规应用的检测 AmpC 酶的方法。方法 用头孢硝噻吩法检测出 97 株 内酰胺酶阳性的肠道 G-杆菌作为试验待测菌，用头孢西丁药敏法、表型筛选法测定细菌耐药情况，以判断产 AmpC 酶的情况。用三维分析法测定细菌粗提物中的 AmpC 酶情况。 结果 97 株肠道杆菌头孢西丁药敏法结果显示产 AmpC 酶共有 36 株，占 37.1%（36 /97） ，与三维试验比较总

2、符合率为 74.2%。表型筛选法产 AmpC 酶的菌株有 15 株，占 15.5%（15/97） ，与三维试验比较总符合率为 91.8 %。结论 表型筛选法与三维试验法比较差异无显著性。表型筛选法可以作为一种临床快速、简便、可靠的检测AmpC 酶的方法。 关键词:头孢西丁药敏法；三维试验；表型筛选法；AmpC 酶 Abstract: Objective using three dimensional taest,phenotype screening taest and Cefoxitin sensitive test to detect AmpC enzyme of intestinal G

3、- Bacillus,then compare and set up a new convenient routine method in clinical laboratoies. Methods Using nitrocefin test 97 lactams nezymes(+)intestinal Bacillus as test.Cefoxitin sensitive test and phenotype screening were performened to detect the resistance in 97 intestinal Bacillus.The three di

4、smensional tests was performened to detect the AmpC enzymes in 97 intestinal Bacillus. Results The results of Cefoxitin sensitive test showed 36 strains produced AmpC enzymes. Cefoxitin sensitive test compared with three dismensional tests,the total coincidence rate was74.2 %(72 /97). The results of

5、 phenotype screening showed 15 strains produced AmpC enzymes. compared with three dismensional tests,the total coincidence rate was 91.8 %(89/97). Conclusions phenotype screening is a reliable to detect AmpC enzyme and easy to use in clinical laboratories. Key words:cefoxitin sensitive test; three d

6、ismensional tests; phenotype screening; AmpC enzymes AmpC 内酰胺酶(简称 AmpC 酶)是由肠杆菌科细菌或/和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的 内酰胺酶，故 AmpC 酶又称作为头孢菌素酶1,2 。随着 内酰胺类抗生素、尤其是头孢菌素的广泛应用，产 AmpC 酶的 G-杆菌越来越多见，已逐渐引起临床医师的关注3 。我科用头孢西丁药敏法、表型筛选法、三维试验检测 97 株肠道 G-杆菌，加以比较，以找出一种合适临床常规应用检测 AmpC 酶的方法。 1 材料与方法 1.1 菌株 从临床病人痰、

7、血、尿、分泌物中分离的 97 株肠道 G-杆菌株，质控菌株阴沟肠杆菌 O29M 和 1194E 从卫生部临检中心购得，分别作为 AmpC酶阳性和阴性对照，大肠埃希菌 ATCC25922 为三维试验指示菌。 1.2 仪器与试剂 M-H 琼脂、肉汤由杭州天和微生物试剂公司购得，低温冰冻离心机为德国 Hettich 公司生产， 型号：Zentrifugen D78532 Tuttlingen,恒温箱，药敏纸片为 OXOID 公司产品。 1.3 头孢西丁（FOX）药敏法4 按 NCCLS 标准 1999 版操作，待测菌株对 FOX 耐药，视为初筛 AmpC酶阳性。 1.4 表型筛选法3 按 NCCLS

8、 标准 1999 版操作，用亚胺培南（IPM） 、头孢吡肟（FEP） 、头孢他啶/克拉维酸（CD02） 、头孢噻肟/克拉维酸（CD03） 、头孢噻肟（CTX）5 种纸片进行筛选。判断标准：FEP、IPM 表现为敏感，而CD02、CD03、CTX 表现为耐药或在 CD02、CD03 和 CTX 的抑菌环内存在散在菌落判断为 AmpC 酶阳性；IPM 表现为敏感，而 FEP、CTX、CD02、CD03均耐药，提示待测菌株产 AmpC 酶的同时也产生其他 内酰胺酶，如产ESBLs。 1.5 三维试验法 1.5.1 酶粗提物的制备5 待测菌于肉汤中增菌，接种于 M-H 平板(直径为 9 cm)中，置于

9、 37 恒温箱内孵育 24 h。刮取 1/4 平板的密布菌落于 1 mL 生理盐水中混匀。-20 反复冻溶 5 次,每次冻的时间不少于 2 h。12 000 r/min，4 离心 15 min，取上清液，经 M-H 平板上常规细菌培养阴性后于-20 保存。1.5.2 三维试验6 将大肠埃希菌 ATCC25922 制成 0.5 麦氏单位的菌悬液，用棉棒均匀涂布于 M-H 平板上，稍干后，在平板中央贴 30 g 的 FOX 纸片，在距离纸片 5 mm 处向外缘方向打一长 10 mm，宽 1 mm 的矢状槽，在槽内加 30 L 粗酶提取物。置于 37 恒温箱内培养 1824 h。观察槽内侧端(FOX

10、纸片的抑菌环内)周围有无细菌生长，如槽附近的抑菌圈缩小或变形均提示细菌产 AmpC 酶，即为三维试验阳性，如抑菌圈无丝毫变化则为三维试验阴性。 1.6 统计学处理 采用 2 检验，以 P0.05 为差异有显著性。 2 结 果 2.1 97 株肠道 G-杆菌都经头孢硝噻吩法检测为 内酰胺酶阳性，其中三维试验 AmpC 酶阳性率为 155%(15/97)。 2.2 头孢西丁药敏法、表型筛选法与三维试验结果符合率比较 见表 1。97 株肠道杆菌头孢西丁药敏法结果显示产 AmpC 酶共有 36 株，占 37.1%（36 /97） ，与三维试验相比总符合率为 74.2%，经卡方检验，差异有显著性(P0.

11、05)。表型筛选法产 AmpC 酶的菌株有 15 株，占15.5%（15/97） ，与三维试验相比总符合率为 91.8 %，差异无显著性（P0.05） 。表 1 三种 AmpC 酶检测法结果比较（略） 3 讨 论 1989 年 Bauernfeid 在汉城首次发现了质粒介导的 AmpC 酶。近年来世界各地陆续报道了各种型别的由染色体和持粒介导的 AmpC 酶。AmpC 酶按其产生的方式分为 3 类：诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶。其中持续高产酶是指菌株因为去阻遏突变，引起 AmpC 酶的大量表达，质粒介导的 AmpC 酶往往都属于此类 AmpC 酶6 。目前认为很多 G-杆菌如肠杆菌属、枸

12、橼酸杆菌属、铜绿假单胞菌等绝大多数均可产生低水平染色体介导的诱导型 AmpC 酶，因而对染色体介导的诱导型 AmpC 酶的检测无多大的临床意义7 。质粒介导的持续高产型 AmpC 酶可见于克雷伯菌、沙门菌、大肠埃希菌等，产生这种 AmpC 酶的细菌具有较强的横向传播能力8 ，此种质粒同时偏码对其他抗生素的耐药性，表现为对第一代到第三代头孢菌素、头霉素、氨基糖苷类及抗假单孢菌青霉素均耐用药，但对碳青霉烯类、第四代头孢菌素和氟喹诺酮类敏感，故对此类质粒介导的持续高产型 AmpC 酶的检测，对于及早发现并控制耐药性的传播具有重要的意义9 ，是临床微生物实验室检测的重点。但目前尚未有一种简便、可靠的适

13、用于临床微生物试验室常规使用的检测方法。酶提取物三维试验虽然是目前公认的质粒 AmpC 酶或（去阻遏）持续高产 AmpC 酶的经典检测方法6 ，而且有准确性高，结果清晰并且容易判读、不存在抗生素诱导等特点，但需反复冻溶菌液、操作烦琐、费时，难以在临床微生物实验室常规应用。 头孢西丁药敏法操作简便，但因不产 AmpC 酶的 G-杆菌对头孢西丁也有一定的耐药率6 ，与三维试验法的总符合率仅为 74.2 %（72/97） ，故此法仅可作为初步筛选方法；表型筛选法操作简便，快速省时，结果基本可靠，跟三维试验法有较高的符合率为 91.8 %（89 /97） ，与赵虎6等报道的符合率(89.58%)相近，

14、且与三维法比较差异无显著性，可以作为临床常规快速检测的方法加以推广应用。 参考文献: 1BUSH K,JACOBY G A,Medeiros A A. A functional classification for lactoamases and it correlation with molecular structureJ. Antimicrob Agent Chemother,1995,39:1 211. 2赵虎，孔宪涛. AmpC 酶及其耐药性J. 世界感染杂志,2002(2):201. 3周志慧,李兰鹃,俞云松,等，两种检测阴沟肠杆菌 Ampc 酶方法的比较J.中华检验医学杂志，20

15、02,25:88 4夏云,赵世巧.用头孢西丁三相试验检测大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的质粒 Ampc 酶J. 重庆医科大学学报,2002,27:425. 5陈东科，张志敏，张秀珍.三维法检测 内酰胺酶的影响因素探讨及方法的改进J. 中华检验医学杂志，2003,26:600. 6赵虎，孔宪涛. AmpC 内酰胺酶的检测J. 中华检验医学杂志，2003,26:390. 7陈民均.细菌对 内酰胺药的耐药性及检测方法J.中华检验医学杂志，2001,24:197. 8BRADFORD P A,URBAN C.Imipenem reistance in klebsiella pmeumomiae is associated with the combination of ACT-1,a plasmid mediated AmpC lactamse,and the loss of an outer membrane proteinJ.Antimicrobil Angents Chemother，1997,41(3):563. 9倪语星. 革兰阴性菌 -内酰胺酶的耐药性问题J. 中华检验医学杂志,2001,24:201.