信号转导和转录激活因子4及γ干扰素在银屑病患者皮损中的表达及其意义.doc

1、信号转导和转录激活因子 4 及 干扰素在银屑病患者皮损中的表达及其意义作者：李常兴，马泽粦，韩春雷，周志刚，胡斌【摘要】 目的 研究银屑病患者皮损内信号转导和转录激活因子4(STAT4)及 干扰素（IFN ）的表达及其临床意义。方法 利用荧光定量聚合酶链反应法测定 20 例寻常型银屑病患者皮损内及 17 例正常对照者皮肤中 STAT4 mRNA 及 IFNmRNA 的定量表达，采用直线相关回归分析方法分析 STAT4mRNA 及 IFNmRNA 的表达与银屑病病情严重指数（PASI）的相关性，STAT4mRNA 与 IFNmRNA 表达的相关性。结果 银屑病皮损内 STAT4mRNA 及 IF

2、NmRNA 的表达均高于正常对照者皮肤内的表达水平（P0.001） 。银屑病皮损内 STAT4mRNA 的表达与患者 PASI呈显著的正相关(r=0.78465,P0.0001)， IFNmRNA 的表达与患者PASI 无显著相关性(r=-0.16125,P=0.4970)。银屑病皮损内 STAT4mRNA 的表达与 IFNmRNA 的表达呈显著的正相关(r=0.62149,P=0.0034)。结论 STAT4 可能通过上调 IFN 的表达，促进银屑病的炎症进程。 【关键词】 银屑病 信号转导和转录激活因子 4 干扰素 荧光定量聚合酶链反应【Abstract】 Objective To stu

3、dy the expression and significance of signal transducers and activators of transcription 4 (STAT4) and interferon gamma (IFN)in psoriatic skin lesion.Methods Twenty adult patients with vulgaris psoriasis and 17 health control were sequentially enrolled in this study. The production STAT4 mRNA and IF

4、NmRNA was detected by realtime polymerase chain reaction. The relationship between STAT4 and disease severity (PASI) was assessed by correlation analysis. The relationship between IFN and PASI was assessed by correlation analysis. The relationship between STAT4 mRNA and IFNmRNA was assessed by corre

5、lation analysis.Results Expression of STAT4 mRNA and IFNmRNA in psoriasis lesional skin was higher than that in control subject （P0.001）.Expression of STAT4 mRNA was markedly positive correlation with PASI(r=0.78465,P0.0001).Expression of IFNmRNA was negative correlation with PASI(r=-0.16125,P=0.497

6、0). Expression of STAT4 mRNA was markedly positive correlation with IFNmRNA (r=0.62149,P= 0.0034).Conclusion Over expression of IFN might be regulated by STAT4. STAT4 might play an important role of in the development and advance of psoriasis.【Key words】 psoriasis；signal transducers and activators o

7、f transcription 4；interferon gamma；realtime polymerase chain reaction银屑病是一种慢性炎症性增生性疾病，严重影响着患者的生活质量，人群发病率为 0.5%4%，Th1/Th2 型细胞因子平衡紊乱可能在银屑病发病过程中发挥着重要的作用1，2 。信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)蛋白家族是近年来发现的一类转录因子，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和 STAT6 等 7 个成员3 。ST

8、AT 家族作为转录因子和细胞因子发生作用的信号通路，是 Th1细胞分化的关键调控因子之一，但 STAT4 在银屑病中的表达情况及其临床意义的研究甚少。本研究采用荧光定量 PCR 法定量测定 STAT4 及IFN 在银屑病患者皮损内的表达及探讨其临床意义，现将结果报道如下。资料和方法 1.一般资料 20 例寻常型银屑病患者为 2006 年 16 月东莞市慢性病防治院皮肤科门诊患者（进行期）,其中男 11 例，女 9 例；年龄范围 2046 岁（平均 36.8 岁） ；病程 10 天3 年。所有患者治疗前 2 个月内未系统应用免疫抑制剂或皮质类固醇制剂或中药机制；银屑病皮损严重指数（PASI）为

9、8.948.6（平均 30.1） 。正常对照者 17 例为健康者外科整形手术切除的皮肤，其中男 9 例，女 8 例,年龄范围 2046 岁（平均36.8 岁） 。2.方法（1）RNA 的提取：组织块置匀浆器，加 TRIZol 冷冻匀浆，提取后的 RNA 置-80保存备用。（2）RNA 样品鉴定：电泳检查：每样品取 5l RNA 置 1%的琼脂糖凝胶上电泳，泳毕，溴化乙锭染色 20 min，置紫外灯下观察。紫外分光光度计测吸光度值及计算样品浓度。（3）引物的设计和合成:参考 16 sRND 基因文库设计引物，STAT4引物序列如下：FO:5- CAT TTG GTA CAA CGT GTC AA

10、C CA -3，RO:5-TGT GGC AGG TGG AGG ATT ATT A -3,引物扩增片断长度为 70 bp，TaqMan Probe:5-FAM-CGA TTC CCA GAA CTT GGT TTT CT-TAMRA-3。 IFN 引物序列如下：Forward Primer:5-TAGCA ACAAA AAGAA ACGAG-3，Reverse Primer:5-CAGGA CAACC ATTAC TGGGA-3扩增片断长度为 117 bp，TaqMan Probe:5-CCAAC GCAAA GCAAT ACATG AACT-3，由 ABI 3900 台式高通量 DNA 合

11、成仪合成。（4）逆转录反应：取 4 l RNA 模板做逆转录反应，仪器为PE9700 PCR 仪，反应体系如下： 5逆转录 buffer 4 l,上游引物（10 pM/l）0.4 l,下游引物（10 pM/l）0.4 l,dNTPs（25 mM）0.2 l,MMLV（10 U/l）1 l, DEPC 水 10 l,总体积 20 l。反应条件：37 1 h，然后 953 分钟。(5)荧光定量 PCR 反应体系进行：由荧光定量仪 PE 7000 型 PCR 扩增仪扩增完成。反应体积为 50l，反应体系：5定量 PCR buffer 10l,上游引物 F1 l ，下游引物 R 1 l，dNTPs 0

12、.5 l，荧光探针1 l，Taq 酶 1.5 l，cDNA 5 l，ddH2O 30 l。反应条件为：93 2 分钟，然后 9345 秒，5545 秒，共 40 个循环。反应结束后，计算待测样本 STAT4 mRNA 及 IFNmRNA 表达量(copy/g RNA)。3.统计学分析 采用 SAS 8.01 for window 统计软件进行统计分析，组间比较采用秩和检验和直线相关回归分析。结果 1.两组 STAT4 mRNA 的表达 银屑病患者皮损内 STAT4 mRNA 的表达明显高于正常对照者皮肤中的表达（表 1） 。表 1 银屑病患者皮损和正常皮肤内 STAT4mRNA 的表达（略）2

13、.两组 IFN mRNA 的表达 银屑病患者皮损内 IFN mRNA 的表达明显高于正常对照者皮肤中的表达（表 2） 。表 2 银屑病患者皮损和正常皮肤内 IFN mRNA 的表达（略）3.银屑病患者 STAT4mRNA、IFNmRNA 与病情 PASI 的相关性 银屑病中 STAT4mRNA 表达与病情 PASI 呈显著正相关性(r= 0.78465,P0.0001)，银屑病中 IFNmRNA 表达与病情 PASI 无显著相关性(r=-0.16125,P=0.4970)，银屑病患者皮损内 STAT4mRNA 的表达与IFNmRNA 的表达呈显著的正相关性(r=0.62149,P=0.0034

14、)。讨 论 银屑病是一种 Th1 细胞和 Th2 细胞平衡紊乱的炎症性疾病。大多数的研究显示银屑病患者外周血和皮损内以 Th1 细胞为主，Th1 细胞因子抑制剂能有效的治疗银屑病1，2，4，5 。银屑病皮损的炎症与 T 细胞介导产生的免疫反应有关，其皮损的表皮增殖与细胞凋亡异常相关：相关研究显示患者皮损内 CD4+和 CD8+T 细胞表达过度2,笔者前期研究发现银屑病患者外周血 CD4+、CD8+T 细胞和 CD4+/IFN+ 细胞表达明显升高，血清 IFN 含量明显升高并与 PASI 成正相关但与病程无关2 ，这些研究表明 IFN 可能参与了银屑病的发病。本研究发现银屑病患者和健康者皮肤均有

15、 IFNmRNA 的表达，但银屑病患者的表达量明显高于健康对照者。此外，银屑病患者皮损内 IFNmRNA 的表达与病情严重程度呈显著的无显著相关性，与前期研究2的患者血清学表达的差异可能的原因有：样本量不同，血液和样本来源不同，研究方法不同。提示银屑病患者体内 Th 细胞分化呈偏态性，以 Th1 细胞为主1 。患者体内 IFN 过度表达促进了银屑病皮损的形成和发展，但银屑病患者体内是通过何种信号途径促进 Th 细胞分化呈偏态性，如何促进 IFN 过度表达的研究甚少。STAT4 是 T 细胞、NK 细胞、树突状细胞和巨噬枯否细胞等免疫调控细胞内 IL12 STAT4IFN 信号传导途径的关键组成

16、元件，是 IL12 诱导免疫调控细胞产生 IFN 的关键调控因子。在 STAT4 基因敲除小鼠，IL12 诱发的所有主要的 T 细胞和 NK 细胞功能反应均明显减弱，其中包括 IFN 产生减少与 Th1 型反应减弱；除此以外，STAT4 还能调控 T 细胞 IL12 受体和 IL18 受体表达以及 T 细胞 NFKB 激活6，7 。因此，STAT4 作为 IFN 产生的关卡，通过直接与间接途径调控 IFN 的产生。本研究发现银屑病患者和健康者皮肤均有 STAT4mRNA 的表达，但银屑病患者的表达量明显高于健康对照者，与 Eriksen 等人4报道的基本一致。银屑病患者皮损内STAT4mRNA

17、 的表达与病情严重程度呈显著的正相关，即 STAT4mRNA 的表达量越高其病情越重，反之亦然。此外，银屑病皮损内 STAT4mRNA 的表达与 IFNmRNA 的表达呈显著的正相关。这些研究结果表明，银屑病患者 STAT4 的过度表达可能直接与间接促进 IFN 的表达，进而促进了炎症细胞浸润，最终形成银屑病皮损。【参考文献】1张锡宝,何玉清,吴志华,等.银屑病患者外周血 CD4+T 细胞内干扰素 、白介素 4 表达与发病的关系J.中华皮肤科杂志,2003,36(3): 151-153. 2李常兴,张锡宝,吴志华.甲氨蝶呤与银屑病J.岭南皮肤性病科杂志,2004,11 (02):200-203

18、.3Levy DE,Darnell JE Jr.Stats: transcriptional control and biological impactJ.Nat Rev Mol Cell Biol,2002,3(9):651-562.4Eriksen KW,Lovato P,Skov L.Increased sensitivity to interferon-alpha in psoriatic T cellsJ.J Invest Dermatol,2005,125(5):936-944.55. 马泽粦, 周志刚, 李常兴, 等. CXCR3 在银屑病患者皮损中的表达及其临床意义J. 右江医

19、学, 2007,35(4):362-364.6Lawless VA,Zhang SM,Ozes ON,et al.STAT4 regulates multiple components of IFN- inducing signaling pathwaysJ.J Immunology,2000,165(12):6803-6808.7Fukao T,Frucht DM,Yap G,et al.Inducible expression of Stat4 in dendritic cells and macrophages and its critical role in innate and adaptive immune responsesJ.J Immunology, 2001,166(7):4446-4455.