血栓与止血的筛选试验及其临床应用.ppt

1、血栓与止血的筛选试验及其临床应用,上海交通大学医学院附属瑞金医院王鸿利 王学锋,迄今，检测血栓与止血的试验逾百种，大致可分为筛选试验、确诊试验、排除试验和基因分析等四大类。本文仅就筛选实验，如出血时间（BT）、血小板计数（PLT），活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT），纤维蛋白（原）降解产物（FDPs）、D-二聚体（D-D），血小板功能分析仪（PFA-100）、血栓弹力图（TEG）的检测其临床应用作一简述。,图1 血管内皮细胞与止血系统,（一）一期出血缺陷筛检试验的应用,1.一期止血缺陷 是指血管壁和血小板异常所引起的止血功能缺陷，主要是由于毛细血管壁通透性、脆性增加或血小板

2、数量、质量异常所致的出血。,2.临床特点 出血以皮肤、黏膜为主，重者可伴有内脏出血；但肌肉、关节等组织出血罕见。 对压迫、缝合、外用止血剂或输注血小板治疗有效，但对血浆和血浆凝血因子制品无效。3.筛选试验 出血时间（BT） 血小板计数（PLT）,筛选试验1.出血时间（BT，模板式刀片法/出血时间测定器法）反映毛细血管壁与血小板相互作用：毛细血管的完整性、收缩性以及血小板数量、功能的实验。参考范围：TBT法：6.92.1 min,临床意义：BT延长（9.0min）（1）PLT与BT呈负相关，PLT愈BT愈。（2）血小板功能异常：血小板无力症、巨血小板综合征、灰色血小板综合征等。（3）部分凝血因子

3、缺乏：低/无纤维蛋白原血症、血管性血友病（vWD）等。（4）遗传性出血性毛细血管扩张症。（5）药物：阿司匹林（ASA）、氯吡格雷（玻立维）和阿昔单抗等。,方法学评价 上海瑞金医院对126例ITP和20例vWD患者检测BT结果列于表1；对BT的三种方法比较见表2。 表1 ITP和vWD应用两种BT法检测的结果,* P0.01,表2 三种BT检测方法的比较,2.血小板计数（PLT） 单位容积的循环血液中所含血小板的数量 （109/L ）。方法：（1）直接血小板计数法（普通显微镜法/相差显微镜法）；（2）血液分析仪（电阻抗法/光散射法）；（3）流式细胞仪法。参考范围：国内：85320 109/L （

4、成人）；通常是100 300 109/L 。,临床意义（1）血小板减少（100 109/L ）：PLT50 109/L ，出血少见；5030 109/L，外伤性出血；20109/L ，自发性出血，常需输注血小板制品。 血小板减少原因：生成减少、破坏增多、消耗过多、分布异常等。（2）血小板增多（ 400 109/L ）：PLT400 600 109/L，需观察；PLT 600 109/L，需治疗； PLT 600 109/L ，需血小板分离。血小板增多原因：骨髓增生性疾病、反应性血小板增多。,方法学评价 ICSH推荐：一般用血涂片法观察血小板分布并与计数核实。（1）草酸胺稀释-相差显微镜计数血小

5、板；（2）流式细胞术计数。 经国际11个实验室用CD41、CD61验证，该法准确度、精密度很好，可作为自动血细胞分析仪的校准和PLT减少的准确性的验证。,图 2 一期止血缺陷的筛选试验,图3 先天性初期止血异常的实验室检查,获得性初期止血异常的实验室检查,（二）二期止血缺陷筛检试验的应用,1.二期止血缺陷 是指凝血障碍和抗凝物质所引起的止血功能缺陷，主要是由于凝血因子缺乏或体内产生病理性抗凝物质所致出血。,2.临床特点 出血以肌肉、关节为特点、也可有内脏、皮肤出血 对血浆、血浆凝血因子制品有效，但对压迫、外用止血剂和输血小板疗效欠佳。3.筛选试验 活化部分凝血活酶时间（APTT） 血浆凝血酶原

6、时间（PT）,图 4 凝血系统及其筛选实验,1.活化的部分凝血活酶时间（APTT） APTT是内源凝血途径的常用和较敏感的筛选试验。参考范围：传统的是3143s；目前随着仪器和试剂的开发，其参考值不一，尚难统一。正常对照值：传统的须测对照值，以测定值较对照值延长10s为异常；目前也未统一。APTTR：患者APTT/正常对照APTT比值，尚未得出参考范围，尚未推广应用。,临床意义（1）内源性凝血途径因子缺陷：F（血友病A）、F（血友病B）、F、F、PK和HMWK等遗传性缺乏症。（2）内源性凝血途径因子抑制物存在：常见F、 F抑制物，狼疮抗凝物（LA），应选用鞣花酸为激活剂更敏感。（3）药物所致异

7、常：常见肝素（患者APTT/正常人APTT比值为1.52.5为治疗范围）、输注库血引起凝血病等。（4）纤溶活性增强：尤其是多见于继发性纤溶亢进（DIC），而原发性纤溶很少延长。,方法学评价（1）激活剂：白陶土、硅藻土和鞣花酸的敏感性比较，见表3 表 3 不同激活剂对APTT敏感度比较,（2）凝血时间检测的敏感性比较：瑞金医院对血友病患者凝血时间的敏感度作比较,延长率（%）：APTT 95%，硅管法CT100%，ACT100%，而试管法CT为70%，故目前用APTT为筛选实验简单、方便、实用。,2、血浆凝血酶原时间（PT） PT是外源凝血系统常用和较为敏感的筛选实验。参考范围：传统法为12 1s

8、（1113s）；目前，随着仪器和试剂不同，参考范围也有不同。尚未统一。正常对照组：传统法为测定值较正常对照组3s为异常，目前也未统一。PTR 参考范围：1.00 0.05，已在应用。,临床意义（1）PT延长：见于遗传性/获得性外源凝血系统的凝血因子缺乏；获得性常见于DIC、依K因子缺乏、口服抗凝剂、肝病；循环血抗凝物质：肝素、FDP、抗因子抗体。（2）PT-INR 多用于监测口服抗凝剂（华法林）。INR1.5提示抗凝剂无效；INR 1.52. 0 用于预防；INR 2.0 2. 5 常规抗凝； INR2.5 3.0 重度抗凝；INR 3.0 易致出血。,方法学评价（1）Hct30%或50%，抗

9、凝剂和血液的比例应按下式调整（表4）抗凝剂量（mL）=（100-Hct）血液量（ mL） 0.00185 表 4 Hct对PT和APTT测定结果的影响,（2）凝血活酶（组织因子）：兔脑、人脑、重组组织因子（rTF）对PT的结果，不尽相同。 rTF 人脑兔脑（3）缓冲剂 其维持血浆pH，防止易变因子失活；如果无缓冲剂，血浆pH增加，PT延长。,（三）、筛选试验的联合应用,主要是PT、APTT和PLT的联合应用。,1）PT（N）、APTT和PLT（N）,2）PT（）、APTT（N）和PLT（N）,3）PT（）、APTT（）和PLT（N）,4）PT（）、APTT（）和PLT（）,5）PT（N）、AP

10、TT（N）和PLT（）,6）有出血症状，但PT（N），APTT（N）和PLT（N）,图 3 先天性凝血异常的实验室检查,表 获得性凝血性障碍项目的选择和应用,（四）纤溶活性增强筛选试验的应用,1、原发性纤溶性增强 指组织型纤溶酶原激活物（t-PA）或尿激酶型纤溶酶原活物（u-PA）的活性增强所致纤溶性亢进2、继发性纤溶活性增强 几乎都见于DIC，是指因子a激活激肽释放酶原（PK）生成激肽释放酶（KK），KK激活纤溶系统所致纤溶活性增强。,3、筛选试验纤维蛋白（原）降解产物（FDP）测定D-二聚体测定（D-D）,图5 FDP和D-D的生成,1、纤维蛋白原（Fg）和纤维蛋白（Fb）降解产物（FDP

11、s）测定 指纤溶酶同时降解Fg和Fb产生的FDPs。（1）定性试验：胶乳凝集法。阴性：血清FDP含量10g/mL，血浆FDP含量5g/mL，尿液FDP含量2g/mL。阳性：血清FDP含量10g/mL，血浆FDP含量 5g/mL，尿液FDP含量 2g/mL。,（2）定量试验：ELISA法。包被于固相的FDP抗体与样本中FDP（抗原）结合，加入酶标抗体后形成夹心复合物，呈显色反应。 参考值：5 g/mL。,2、D-二聚体（D-D）测定 指纤溶酶特异性降解纤维蛋白（Fb）所产生的降解产物。（1）定性试验：胶乳凝集试验。阴性：无凝集颗粒者，即D-D含量0.5g/mL阳性：有凝集颗粒者，即D-D含量0.

12、5g/mL半定量：以0.5g/mL、 0.5g/mL阳性时的最大稀释倍数。,（2）定量试验：ELISA法。 参考范围： 0.5g/mL（3）定量试验：胶体金法。将血浆加入检测卡孔内，血浆中D-D吸附于包被有D-D单抗膜中，再加入D-D单抗-胶体金耦联物溶液，膜中D-D将与金标抗体发生结合反应，用光笔阅读仪读数。 参考范围： 0.3 mg/L,临床应用（1）纤溶活性增强筛检试验的应用 FDP正常，D-D正常：多数为正常人，提示无纤溶过度现象。 FDP阳性，D-D正常：多数为FDP的假阳性或原发性纤溶症。 FDP正常，D-D阳性：多数为FDP假阴性或继发性纤溶症。 FDP阳性，D-D阳性：多数为继

13、发性纤溶症，常见于DIC。,（2）在诊断DIC中的应用 见表 5 表5 FDP和D-D在诊断DIC中的应用,(3)D-D在排除静脉血栓（VTE）中的应用 D-D测定在排除VTE中有重要价值（表6）。 表 6 D-D测定在排除VTE中的应用,方法学评价（1）对VTE的诊断：D-D测定有高度敏感性和阴性预测值，但特异性较低。因此，D-D测定阴性可排除VTE，阳性不一定是VTE。（2）D-D测定，WHO规定用ELISA法，临界值为500 g/L。因此D-D测定值500 g/L排除VTE，几乎为100%， 500 g/L诊断VTE的可能性为40%，必须结合其他影象检查。,（3）D-D测定阴性时，结合临

14、床低/中危险度，其排除价值更大；D-D测定阳性时，结合临床高危险度和影象检查诊断价值更大。（4）FDP和D-D阳性可见于老年人、妊娠、癌肿、DIC、肝病、感染、炎症、创伤、手术、溶栓治疗、冠心病等。判断结果时要充分考虑。,（五）DIC筛选试验的应用,诊断DIC必须符合下列4项：（1）引起DIC的基础疾病：病因诊断（2）有DIC的临床表现：临床诊断（3）DIC的实验室检查：实验诊断（4）对肝素治疗有效：治疗诊断,临床应用1、国外DIC的记分诊断标准（表9）,2、国外DIC的记分诊断标准（表10）,3、日本厚生省DIC诊断记分标准 表11,注：计分7分确诊DIC，计分6可疑DIC，5则可能性少，可

15、疑时补做：Sfmc、DD、TAT、PAP，动态plt，抗凝治疗有效,4、国内基层单位DIC诊断标准（1999）对临床怀疑，有下列7项中3项即可诊断DIC（1）PLT50109/L或进行性（2）Fg 1.5g/L或4.0g/L，且呈进行性变 化（3）3P试验（+）或FDP 20mg/L（4）PT缩短/延长3s，或呈动态变化（5）外周血涂片破碎红细胞10%（6）ESR 15mm/h（7）血凝块在2h内出现溶解现象,方法学评价1、DIC常用实验指标的评价（表7）,2、DIC联合实验指标分析（表8）,方法学评价 见表7、表8。我院对864例DIC患者进行统计，它们的敏感性、特异性和诊断准确率分别为60

16、%、66%和63%；对DIC前期109例患者的敏感性、特异性和诊断准确率分别为80%、68%和74%。Wada等（2003）DIC的诊断标准作了前瞻性评价，结果显示：敏感性为91%，特异性为97%。由此可见，所用DIC实验诊断指标，基本上可以满足临床需求。,（六）自动化仪器在血栓 与止血筛选试验中的应用,1、血栓弹力图（thrombelastograph，TEG） 承载全血标本的测试杯以445左右摆动，当杯中凝血启动，置于杯中的金属针受到凝血块生成/溶解的切应力作用，随之一起摆动。金属针在摆动过程中所产生的电流，经电脑软件处理后，便形成曲线。这种仪器称血栓弹力仪，所形成的曲线称血栓弹力图（TE

17、G）,图6 TEG各参数的形成,表 12 TEG主要参数及其含量,临床应用,（1）判断凝血状态：低凝、高凝状态 低凝状态：R、K值都延长 高凝状态：R、K值都缩短 指导血浆制品的选择（2）判断肝素/LMWH疗效：有效、过量、抵抗 普通检测R、K值=肝素R、K值，示无肝素存在 普通检测R、K值肝素R、K值，示有肝素存在 指导肝素/LMWH使用和鱼精蛋白中和,（3）判断抗血小板治疗：有效、过量、抵抗 用TEG的血小板定位图（platelet mapping）。 使用抗血小板药后血小板抑制率20%为抵抗。 使用抗血小板药后血小板抑制率50%75%为有效。（4）评估非心脏手术后血栓事件的发生率 应该维

18、持MA值67mm将大大降低血栓事件 若MA值 67 72mm，血栓发生率为16%。 若MA值 72 95mm，血栓发生率为32%。,（5）评估PCI后血栓事件的发生机率 若PCI后，MA值6568mm，发生率为10%。 若PCI后，MA值6872mm，发生率为14%。 若PCI后，MA值72mm，发生率为60%。（6）其他应用 区别原发性纤溶和继发性纤溶（DIC） 判断高凝状态原因：凝血亢进、血小板活性 鉴别手术出血：外科出血、内科出血,2.血小板功能分析仪（platelet function analyzer-100,PFA-100) 体外筛选血小板黏附和聚集的仪器。以标有胶原/腺上腺素（C

19、EPI）和胶原/ADP（CADP）两种纤维膜为诱导剂，以观察膜孔闭合时间（closure time，CT）为结果。参考范围 CEPI为61203s；CADP：48 187s,In Vivo Haemostasis,PFA100.avi,capillary 200m,aperture150m,epinephrine or ADP,platelet,vWF,erythrocyte,FLOW,- 40 mbar,collagen,membrane,PFA-100 Test Principle,lumen,fibrinogen,platelet,collagen fibrils,erythrocyte

20、,endothelial cell,vWF,临床应用 一期止血缺陷的筛选试验。敏感性：CEPI/CADP为82.5%/66.9%特异性： CEPI/CADP为88.7%/85.5%阴性预测值： CEPI/CADP为83%/75%阳性预测值： CEPI/CADP为88%/79%,vWD：CEPI/CADP的敏感性为88%/87%；特异性为95%/95%。血小板无力症：CT延长，可替代BT，准确、可靠。服用ASA时：CEPI的CT延长，CADP可正常；与其他疾病与药物诱导血小板功能异常鉴别的敏感性和特异性分别为100%和50%。,方法学评价 PFA-100操作简便、快速、结果准确。CEPI/CADP的变异系数为12%/8%，与PAgT有良好相关性。 受PLT、贫血（Hct30%）、O型血型、3.8%枸橼酸盐和富含核黄素食物等的影响；Fg的裂解肽可影响 Fg-vWF/GPb-a的结合,图 实验室检测的全面质量管理注：分析测定包括：工作环境、人员素质、室间质评、室内质控、仪器设备、操作标准、试剂准备、方法选择。,分析中质量保证,谢谢，请指导。,