分子生物技术.pptx

1、分子生物技术在生理学中的应用,杜军生理学系,细胞复苏和传代的基本过程,1、从液氮中取出冻存管，迅速移入37温水中，轻轻摇动，令其内容物尽快融化。2、取出冻存管置于超净台中，用酒精消毒后旋开盖子，用吸管吸出细胞悬液，放入离心管并加入10倍以上的完全培养基，1100rpm离心5 min，去上清。3、加入完全培养基约4 mL，吹匀后接种于细胞培养瓶中。置于37、5% CO2的培养箱中静置培养，次日更换一次培养基。,4、待细胞长至致密单层时移去培养基，用PBS清洗细胞2次，加入37预热的0.25% 胰蛋白酶2mL消化3min左右。显微镜下观察到细胞逐渐变圆但尚未离壁时，吸走胰酶。5、加入约2mL DM

2、EM完全培养基吹打使细胞悬浮，室温下1100rpm离心5min，弃上清。细胞沉淀中加入DMEM完全培养基，按5105个细胞/mL的密度接种于培养瓶中，置于37、5% CO2细胞培养箱中培养。,细胞划痕实验的基本过程,（1）制备培养单层细胞：将细胞密度为1105的细胞接种于96 孔培养板中，每组设多个平行样本，常规培养至形成细胞单层；（2）人工划痕：在单层培养细胞上，用移液器吸头沿培养板底部作“一”字形划痕，倒置显微镜下拍摄并确定划痕边缘区域。将培养液更换为无血清培养液，按分组要求继续培养；（3）迁移能力测定：细胞处理结束后，倒置显微镜下拍照并确定划痕边缘，计算处理前后划痕边缘相对距离的差值。,

3、transwell实验的基本过程,（1）胰酶消化对数生长期细胞，制备细胞悬液。 （2）按每孔100L（细胞数为5104）加入24 孔板中8.0m孔径博伊登小室上层，小室下层加入600L的DMEM培养基，37条件下孵育1h。（3）随后向小室下层培养基中加入刺激物（如血清、EGF），继续培养24h。（4）将小室从24孔板中取出，用4%多聚甲醛固定细胞20min后，用棉签轻轻擦去膜上表明未迁移通过膜的细胞。（5）随后用0.1%结晶紫染色5min，清水漂洗3次后，倒置显微镜下观察，计所有穿过膜的细胞数。,采用TRIzol试剂（Invitrogen）提取细胞总RNA，取1.0g RNA样品，采用Supe

4、rScript First-Strand Synthesis kit (Invitrogen) 试剂盒合成cDNA。采用SYBR Green PCR master mix试剂和ABI 7500 Fast Real-Time PCR System仪器进行定量PCR检测。采用Ct值的方法对各个样品中基因表达水平进行相对定量。引物由上海捷瑞公司合成。,qPCR实验的基本过程,（1）提取总RNA 细胞分组处理后，每孔加入1ml Trizol，混匀，使细胞充分裂解后，移入1.5ml 无RNase离心管中，室温静置3-5min； 加200l氯仿，充分混匀，室温静置2 min； 将离心管于4，12000g，

5、离心20min； 用移液器小心吸出上层液相，放入另一离心管中； 加入与所移出上层液相相同体积的异丙醇，以促进RNA沉淀，轻轻混匀，室温静置10min； 4，12000g，离心10min，弃上清； 在沉淀中加入1ml 75 %乙醇（DEPC水现配），轻轻洗涤沉淀； 4，12000g，离心5min，弃上清； 重复步骤； 稍微晾干沉淀，约10min，在RNA略显透明时，加入50100l DEPC水溶解RNA，4静置过夜使沉淀充分溶解，-70保存。,PCR实验的基本过程,（2）定量和检测总RNA 紫外分光光度计检测RNA的产量，用98l DEPC水调零后，加2l RNA样品，在260nm处的吸光度，1

6、OD=40g/ml； 根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0（比值最好在1.9-2.1之间）。,（3）RT-PCR 取1g总RNA进行反转录，37，1h，合成cDNA； 引物分别为：VEGF 5-ACCAAGGCCAGCACATAGG-3 (sense) 和 5-ACGCTCCAGGACTTATACCG-3 (antisense)；内参为18S rRNA 5-ACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3 (sense) 和 5-CTGACCGGGTTGGTTTTGAT-3 (antisense)； 根据样品数目依说明书混合PC

7、R反应体系，分至每个PCR小管，每管加入1l cDNA产物，PCR条件按说明书，共40次循环；, PCR产物的鉴定A. 0.6g琼脂糖加入1TAE 50ml，微波炉加热至琼脂糖溶解，稍微冷却后加入GoldView染料2.5l，混匀，铺板凝固后使用；B. 电泳槽中注入1TAE溶液至高于凝胶面，PCR产物加相应体积的6加样缓冲液，混匀上样，用DNA 标准品作为参照，110V电泳20min；C. 紫外灯下观察电泳结果并拍照保存。, 全蛋白提取细胞分组处理后，用预冷的PBS清洗细胞2次后吸干残留的PBS；加预冷全蛋白提取缓冲液0.5ml，冰上振荡裂解细胞15min；细胞刮刀刮取细胞，上下吹打细胞数次，

8、使其悬浮，吸取细胞裂解悬液转移至预冷的1.5ml EP管中，冰上振荡15min；4离心（12,000rpm，20min）；将上清转入预冷的1.5ml EP管，-70保存备用；BCA法测定蛋白浓度。,免疫印迹实验的基本过程, 免疫印迹将蛋白样品与加样缓冲液混合，100加热5 min，离心3 min，取上清加样后进行蛋白电泳；电泳条件为初始电压80 V（30 min），待样品进入分离胶后，电压增至110 V，直至电泳结束；电泳结束后，用硝酸纤维素膜进行转膜。转膜电流1.2 mA/cm2胶面积，250mA恒流湿转2h；转膜完成后，用立春红染液染色观察转膜效果，TBST洗去立春红（此步染色可省略）；纤

9、维膜与5 %封闭液室温孵育1h；TBST缓冲液洗膜5 min3次；加一抗，杂交袋内平缓摇动，4过夜；回收一抗，TBST缓冲液洗膜5 min3次；加相应二抗，杂交袋内平缓摇动，室温1 h；弃液体，TBST缓冲液洗膜5 min2次，TBS缓冲液洗膜1次；加发光底物ECL，凝胶成像及分析系统拍照并进行图像灰度扫描，分析比较目标条带的净光密度值。,褪黑素对SGC-7901人胃癌细胞粘附和迁移的影响,目的：研究褪黑素对SGC-7901人胃癌细胞粘附和迁移能力的影响及探索可能的分子机制。方法：用不同浓度的褪黑素孵育人SGC-7901人胃癌细胞24h，通过免疫印迹方法检测F-actin和G-actin蛋白表

10、达水平，通过免疫荧光法检测细胞骨架结构的改变，通过细胞粘附实验观察胃癌细胞对血管内皮细胞粘附能力的变化，通过划痕实验检测褪黑素对细胞迁移能力的影响。结果：褪黑素使SGC-7901人胃癌细胞F-actin量明显降低，同时细胞骨架结构发生重组，应力纤维出现断裂；褪黑素可抑制胃癌细胞对血管内皮细胞的粘附及迁移能力。结论：褪黑素可能通过破坏细胞内应力纤维结构的稳定，最终导致了胃癌细胞的粘附和迁移能力的降低。,图1 褪黑素对SGC-7901细胞骨架和胞浆组分中actin分布的影响。正常组和1mM褪黑素处理组比较， *P0.05, n=3。Fig 1 The redistribution of actin

11、 during melatonin treatment in SGC-7901 cells,图2 褪黑素诱导SGC-7901人胃癌细胞细胞骨架发生重构(荧光显微镜，400)Fig 2 Melatonin induced rearrangement of cytoskeleton in SGC-7901 human gastric cancer cells (Fluorescence microscopy，400),两组间比较：正常组和1mM褪黑素处理组比较， *P0.05, n=6。图3 褪黑素抑制SGC-7901人胃癌细胞的迁移能力Fig 3 Melatonin suppressed migration of SGC-7901 human gastric cancer cells,倒置显微镜图片(200)； B. 荧光显微镜图片：1. 0h (200)，2. 1h对照组 (100)，3. 1h 1mM褪黑素处理组 (100)；C. 两组粘附率统计图。与对照组比较： *P0.05，n=6。图4 褪黑素抑制SGC-7901人胃癌细胞的粘附能力Fig 4 Melatonin suppressed adhesion of SGC-7901 human gastric cancer cells,