WHO人类精液检验与处理实验手册第五版.doc

1、1致 谢本手册的出版由 UNDP/UNFPA/WHO/世界银行人类生殖研究、发展和研究培训特别规划署及 WHO 人类生殖健康与研究部共同完成。我们对所有参与本手册筹备、编辑和校订的人员表示诚挚的感谢。另外感谢：Ms Cathy Treece, Ms Charlene Tollner 和 Jim Overstreet 教授(University of California, Davis, CA, USA)提供形态学显微照片以及对媒体文件的校对；Dr Rune Eliasson (Sophiahemmet Hospital, Stockholm, Sweden) 帮助定义非精子细胞；Dr Gary

2、 N Clarke (The Royal Womens Hospital, Carlton, Australia), Dr Roelof Menkveld (Tygerberg Academic Hospital and University of Stellenbosch, Tygerberg, South Africa)和 Pieter Wranz 教授(University of Stellenbosch, Tygerberg, South Africa) 对本手册编译工作提供附注。衷心感谢国际男科学会提供的经济支持。这个版本的手册是为纪念已故前 WHO 男性生育调控方法学工作组负责人G

3、eoffrey Waites (1928-2005)，他也是第二、第三和第四版实验室手册的共同编辑。编辑委员会全身心投入工作的动力来自于对 Geoff 诚实、公平和关心疾苦人格的欣赏。2缩写词Ab antibody 抗体AI artificial insemination 人工授精AID artificial insemination with donor semen 供精人工授精AIH artificial insemination with husbands semen 夫精人工授精ALH amplitude of lateral head displacement 头侧摆振幅ANOVA

4、analysis of variance 变量分析APAAP alkaline phosphatase: anti-alkaline phosphatase complex 碱性磷酸酶: 抗碱性磷酸酶复合物AR acrosome-reacted 顶体反应 ART assisted reproductive technology 辅助生殖技术ASA anti-sperm antibody 抗精子抗体BCF beat-cross frequency (Hz) 交打频率BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白BWW Biggers, Whitten and Whittingha

5、m 试液CASA computer-aided sperm analysis 计算机辅助精子分析CASMA computer aided sperm morphometric assessment 计算机辅助精子形态评估CBAVD congenital bilateral absence of the vas deferens 先天性双侧输精管缺失CD compact disk 压缩盘CD cytoplasmic droplet 胞质小滴CD45 cluster of determination 45 (pan-leukocyte marker) 决定簇 45 (全白细胞标记物)CD46 cl

6、uster of determination 46 (acrosomal antigen) 决定簇 46 (顶体抗原)CI confidence interval 可信区间CL confidence limits 可信界限CO2 carbon dioxide 二氧化碳DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸DPBS Dulbeccos phosphate-buffered saline Dulbeccos 磷酸缓冲盐溶液DVD digital versatile disc 数字多用盘EDTA ethylenedi

7、amine tetra-acetic acid 乙二胺四乙酸（依地酸）EQA external quality assurance 外质量保险EQC external quality control 外质量控制ERC excess residual cytoplasm 残余胞质FITC fuorescein isothiocyanate FMLP formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine 甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰- 苯丙氨酸GIFT gamete intrafallopian transfer 输卵管内配子移植术GPC glycerophosphocholine

8、H2O2 hydrogen peroxide 过氧化氢HBSS Hanks balanced salt solution Hanks平衡盐溶液HBV hepatitis B virus 乙肝病毒hCG human chorionic gonadotrophin 人绒毛膜促性腺激素3HCV hepatitis C virus 丙肝病毒HIV human immunodefciency virus 人免疫缺陷病毒HOP hamster oocyte penetration 仓鼠卵穿透HOS hypo-osmotic swelling 低渗肿胀试验HPF high power field 高倍视野H

9、RP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶HSA human serum albuminxiv 人血清白蛋白 IVHTF human tubal fuid 人输卵管液IB immunobead 免疫珠IBT immunobead test 免疫珠试验ICSI intracytoplasmic sperm injection 胞浆内精子注射Ig immunoglobulin 免疫球蛋白IM immotility 不动IQC internal quality control 内质量控制IU international unit 国际单位IUI intrauterine in

10、semination 宫腔内人工授精IVF in vitro fertilization 体外受精KRM Krebs-Ringer Medium Krebs-Ringer 培养液LIN linearity 线性LLQ lower limit of quantifcation 定量下限LPF low power field 低倍视野MAD mean angular displacement 平均角位移MAI multiple anomalies index 复合异常指数MAR mixed antiglobulin reaction 混合抗球蛋白反应NA numerical aperture 数值

11、孔径NP non-progressive (motility) 非前向的（活力）PBS phosphate-buffered saline 磷酸缓冲盐溶液PDCA plan, do, check, actPMA phorbol 12-myristate 13-acetate (12-)十四酸佛波酯(-13-) 乙酸盐PMSG pregnant mare serum gonadotrophin 孕马血清PNPG p-nitrophenol glucopyranoside 对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷PR progressive (motility) 前向的（活力）PSA Pisum sativum a

12、gglutinin 碗豆凝集素QA quality assurance 质量保险QC quality control 质量控制RCF relative centrifugal force 相对离心力RI refractive index 屈光指数RNA ribonucleic acid 核糖核酸ROS reactive oxygen species 活性氧类物质rpm revolutions per minute 每分钟转速SD standard deviation 标准差SDI sperm deformity index 精子畸形指数SDS sodium dodecyl sulfate 十二

13、烷基硫酸钠SE standard error 标准误4SOP standard operating procedure 标准操作流程STR straightness (VSL/VAP) 直向TBS Tris-buffered saline Tris 缓冲盐溶液TGG Tyrodes glucose glycerolTZI teratozoospermia index 畸形精子症指数VAP average path velocity 平均轨道速率VCL curvilinear velocity 曲线速率VSL straight-line (rectilinear) velocity 直线速率WH

14、O World Health Organization 世界卫生组织WOB wobble (VAP/VCL) 摆动5第 1 章 背景1.1 导言鉴于人类精液检查标准化需求的日益增加，世界卫生组织于 1980 年首次出版了世界卫生组织人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册 。至今，该手册已改版三次，被译成多国语言。过去 30 年中，该手册作为全球范围内的标准被世界各地的临床及科研工作者广泛使用。尽管前几版的发行很成功，但是随着新证据的出现，先前版本中的一些推荐指标需要被修正就变得更明显了。同时，对一些概念也需给出更多的解释和支持证据。出于上述考虑，WHO 成立了编辑委员会，回顾手册中描述

15、的各种方法，本版旨在修改、更新这些内容。由于按照先前版本中讲述的方法获取的数据不充分，某些情况下修正工作变得异常困难。有时，某些实验室可以获得的一致结果，在其他实验室却无法得以验证。鉴于这些情况，编辑委员会在对以往文献资料评估后，达成一致，统一标准。由于需要对先前版本中讲述的方法进行更详细的描述，技术员和科学工作者们给出了补充推荐内容。因为前几版手册缺乏对细节的描述，一些实验室采用其它方法或是发展出自己的操作规程，然而他们却仍申称是按照 WHO 手册进行精液分析的。为了使全球范围内的比较更容易实现，第五版手册包含了更多的细节描述。当提出不同的分析方法时，手册中对原由做了解释。参照该手册在发表论

16、文中报道实验结果时，我们推荐各个实验室要指明所采用的是哪一种方法。1.2 第 5 版第 5 版包含三部分内容：精液分析（第 2-4 章） ，精子制备（第 5、6 章）及质量评估（第 7 章） 。第部分介绍精液分析，参照先前版本，但被分为三个小章节：标准化方法（介绍决定精液质量的常规操作流程） ；可供选择的试验（这些试验用于某些特定情况下或由实验人员选择） ；研究试验（这些试验目前不作为精液常规分析的方法） 。由于通常在男科学实验室不能开展精液培养，因此这些内容仅在无菌化精液标本采集部分提及。精子制备章节的内容从射出精液扩展到对睾丸和附睾获得精子的制备。本手册中散在分布的方法学注释框有6注解(方

17、法学解释) 、评论（结果解释）以及说明框(包括补充解释的物质)。第 5 版手册的主要特点如下所列： 精液分析章节包括涉及工作溶液的配制、操作流程、精子计数及对结果解释的详细描述，以使所有给出的方法学都非常完整，与手册中其它章节内容的重叠极少。 扩展了精子制备部分的内容，增加了关于精子冷冻保存的新章节。与宫颈粘液分析相关的操作规程被分到可供选择的试验章节及附录中粘液特征的检查部分。 与先前的版本相比，第五版的附录内容减少。这部分内容仅限于特殊的或者很少被用到的信息。 精子数目的评估。对于一份精液标本的检查，精液的稀释度和评估精子数目所需观察的计数池区域的大小均有所改变，每次需计数 200 条精子

18、。新版手册中强调了抽样误差的重要性及计数结果的确定性。编辑委员会认为每次排精的总数目比精子密度能更准确的评估睾丸功能，但这要求对精液量的测定需准确无误。 无精子症的评估。这尽管表面看起来简单，但很多因素会影响无精子症的诊断，包括计数太少数目精子导致的明显误差，观察显微镜视野的数目，以及检验布满碎片精子沉淀物的困难度。本手册推荐改为检验固定后、未离心的标本，以及指出所用计数方法的灵敏度。然而，当需收集足够数目的精子用于治疗时，离心方法仍是必需的。另外，手册中也介绍了通过检验未固定标本中的活动精子以评估输精管切除术疗效的方法。 精子活力的评估。第五版与先前版本的主要不同在于对精子活力的分级。目前推

19、荐精子活力被分为前向运动、非前向运动的不动精子（而不再分为 a, b, c 和 d 级） 。 精子形态的评估。一些实验室仅仅评估正常精子的比例，然而有些人认为形态异常的类型、部位及程度更加重要。 质控。此章第五版为重新编写。精液分析过程的健全对于精液分析严格质控至关重要。当质控结果不满意时，文中的提示和建议有助于增进实验室水平。7 参考范围和参考低值。本手册参考范围值来自 12 个月以内配偶获妊娠的男性的精液数据。原始数据为来自 3 大洲的 8 个国家的可生育男性的 400-1900份精液样本。传统统计学方法为取双向参考区间的第 2.5 百分位作为阈值，低于此阈值则可认为来自不同的人群。但是，

20、单向参考区间更适用于精液分析，因为任意参数的高值并不能对生育作出决定性的判断。第 5 百分位可作为最低参考值，每一参数的完全分布区间见附录 1。1.3 本手册的范围本手册所载的方法可作为指南以增进精液的综合分析和可比性。但并非为地方、国家或全球性的实验室认证机构所必备。精液分析在临床和研究机构对男性生育功能的调节和追踪中，其对男性生育状态和精子发生的监控都是极为必要的。（上海交通大学医学院附属第九人民医院生殖中心 曹少峰博士）8第2章 标准程序2.1 简介正常精液是一种混合物，在射精时由睾丸和附睾的分泌液及悬浮其中的精子与前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成。最终射出的混合物是一种粘稠的液

21、体，即射出的精液以团块状连续数次射出，通过输精管切除术前后的比较显示，就体积而言有90%是自附属腺体的分泌物，其中主要是前列腺和精囊腺，少部分来自尿道球腺和附睾。精液的两个主要量化指标：1精子总数，反应睾丸的生精状况和睾丸后管道系统的通畅程度。2体积反应腺体的分泌能力。精子功能组要受精子自身的活力、运动、形态和精浆成份的影响。在性交排精时，最初富含精子和前列腺液部分的精液可能和延续在阴道中宫颈粘液丝相互接触，而其余部分在形成而在实验留取标本时，全部精液留取在一个容器中，精子限在由精囊腺分泌蛋白导致的凝块中，随后在前列腺分泌的酶作用下而水解。有证据表明精液样本质量的变化与取样方式和地点有关，通常

22、在家里用性交法留取的质量较高，说明不同排精方式明显影响样本的检验结果。在固定条件下精液样本质量主要受睾丸生精功能、附属腺体的分泌、近期患病情况尤其高热性疾病，及其以它如禁欲时间的长短，这些在解释监测结果时都应考虑进去。精液质量分析结果主要受以下因素的影响：1样本收集是否完整。射精时前面富含精子部分的精液避免丢失，后面部分精液主要是由精囊腺的分泌物构成，所以，前面部分精液的丢失比后半部分丢失对精液分析结果影响更大。2在射精时，附属腺体分泌物冲淡含高度浓度精子的附睾液。精子浓度不能直接反应睾丸的精子产量，因为还受其他生殖器官功能的影响，而精子总数（精子密度X精液体积）精子密度对于年轻人和老年人没有

23、区别，但精子总数9可能存在差异，至少人群中有部分人存在随着年龄增大而精液体积和精子下降的现象。3精子的活力和染色体不受禁欲时间长短的影响，除非附睾功能受到影响。由于前次射精不彻底，附睾没完全排空，有部分精子残存，精子老化会影响精子质量，其程度很难确定，所以也很少做考虑。4睾丸体积的大小不仅能反应睾丸的生精水平还影响到每次射精的精子总数和精子形态。 注释： 精液质量的巨大生理变化是上述所列多种因素的反映 (Castilla等 ., 2006)，因而同精液相关的所有分析都要精确全面。这些多变的非可控因素解释了众所周知的个体精液成分的变化(Baker Alvarez 等,2003). 图2.1 显示

24、了参与一个雄性激素避孕药研究的安慰剂组的5名年轻志愿者，根据WHO推荐的方法的精液评估结果，其精液成分是伴随时间发生变化的。这一变化表明要对精液分析进行如下说明：1仅凭一次精液检查不能确定精子质量。2检查两到三次有助于获得可靠的基本数据(Poland 等, 1985; Berman 等, 1996; Carlsen等, 2004; Castilla 等, 2006; Keel,2006)。虽然对整个精液样本进行了分析，但其结果并不能确定那些少数到达受精部位精子的受精能力，精液分析能为临床提供有关患者个人状况的一些重要信息。样本的采集和检查都按照规范化程序进行，其结果才有价值。本章所述操作流程被认定为进行精液评估的基本组成步骤。10图 2.1 在超过18个月的时间内精子总数目和精液浓度的变化（以上数据提供由先灵葆雅和拜耳药业提供）精液分析包括以下几个步骤（在以后章节中详述）：【在最初五分钟】将受精精液样本容器放置在温控台或水浴箱里（37）等待液化。在30到60分钟期间评估精液的液化情况和物理性状。测量精液体积。如有需要则检测精液的pH值。准备湿片观察显微镜下精子的活动情况，计数时还需进行稀释。如活动精子较少，需评估精子活动率。制作精液涂片评估精子形态。