基因工程绪论.ppt

1、,绪 论,The formation of new combinations of heritable material by the insertion of nucleic acid molecules，produced by whatever means outside the cell， into any virus, bacterial plasmid or other vector system so as to allow their incorporation into a host organism in which they do not naturally occur b

2、ut in which they are capable of continued propagation.,第一节 基因工程的诞生,在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。,一、基因工程的定义,二、基因工程诞生的理论基础,1 . DNA是遗传物质,1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。,1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。,（1）肺炎双球菌转化实验,（2）噬菌体转染实验,1953年

3、James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。,2. DNA双螺旋结构,1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”,DNA,RNA,protein,1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码,3. 中心法则和遗传密码,三、基因工程诞生的技术突破,1. 限制性内切酶（restriction enzymes）,1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。,Werner Arber 理论预见限制酶,Daniel Nathans 用限制酶切得S

4、V40 DNA片断,Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶,1978年Nobel生理或医学奖,2. DNA连接酶（ligase）,1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。,3. 载体（vector）,1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。,4. 感受态体系,1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。,5. 琼脂糖凝胶电泳,1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。,6. DNA测序技术,1975年F

5、. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术。,1980年Nobel化学奖,四、基因工程的诞生,1980年Nobel化学奖,1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组实验：,1. Berg的开创性实验,将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来。,（用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶）,2. Boyer-Cohen实验,1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。,后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC1

6、01质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。,Boyer-Cohen实验,Stanley Cohen 1986 Nobel生理或医学奖,Herb Boyer,外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。,1. 跨物种性,2. 无性扩增,外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。,五、基因工程的特征,2. 重组体的制备,六、基因工程的主要操作内容,1. 目的基因的获取,从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。,将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。,将重

7、组体（载体）转入适当的受体细胞中。,4.克隆鉴定,3.重组体的转化,挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。,5.目的基因表达,使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。,基因工程,制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。,1. 对环境的影响,2. 新型病毒的出现,重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。,一、基因工程的安全隐患,第二节 基因工程的安全性,将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。,4. 人造生物扩散,新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危

8、险。,3. 癌症扩散,1. 公众的担忧,二、重组DNA研究的安全准则,1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。,1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请Paul Berg博士组成一个重组DNA咨询委员会。,这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。,2. 专家的态度,3.制定安全规则

9、,1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。,规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。 1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。,分4级：P1P4级。,（1）实验室的物理安全,4. 基因工程的安全措施,一般装备良好的普通微生物实验室。, P1级实验室, P2 级实验室,在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。,全负压的实验室，同时装备安全操作柜。, P4级实验室,专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。 具有最高安全防护措施。, P3 级实验室,在自然环境中无法存活。,（2）实验室的生物安全,分3 级

10、（大肠杆菌）：EK1EK3级。, EK1级的大肠杆菌,在自然环境中一般都要死亡。, EK2-EK3级大肠杆菌,第一个“安全”菌株是K12（1976年），很不实用，已淘汰。,（3） 载体的安全,应该是失去了自我迁移的能力。,不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。 （容易构建）。如pMB9，pBR322等。,一、基因工程在农业生产中的应用,1. 提高植物的光合作用效率,第三节 基因工程的应用,改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。,（1）提高CO2的固定率,改变光能交换系统的分子的基因结构。,（2）提高光能吸收率和转化率,使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生

11、固氮。,2. 提高豆科植物的固氮效率,是农业生物技术的主要内容。 是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。,3. 转基因植物,世界各国转基因作物大田释放情况（1987.1-1998.4）,中国已经批准进入大田的转基因植物（1998.3）,将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。 使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。,4. 转基因动物,在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物（TPA）和尿激酶的转基因小鼠； 分泌a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等。,二、基因工程在工业中的应用,克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉

12、价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。,用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。,1. 纤维素的开发利用,2. 酿酒工业,三、基因工程在医药上的应用,1976年，27岁的风险投资人Robert Swanson与University of California的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（Genetic Engineering Technology）。,第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！,Genentech的骄人业绩,制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝

13、、霍乱、痢疾、SARS）,2. 用微生物生产药物,3. 技术设计高效高特异性的生物制剂,4. 研制疫苗,1. 用转基因植物或动物生产药物,大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等,应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂,美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）,1,中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）,6. 法医鉴定,7.基因治疗,5. 基因诊断,将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。,基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病等。,（仍在探索阶段）,医药,药物基因组学,人工设计,克隆P450s,疾病的动物模型,治

14、疗性小分子,植物,微生物,诊断用蛋白,治疗性蛋白,微生物,动物,疫苗,植物,微生物,治疗性核酸,基因治疗,基因修复,反义药物,DNA疫苗,诊断性核酸,遗传病,传染病,用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。,四、基因工程在环境保护中的应用,1. 检测水污染,2. 生物降解,用重组细菌或转基因鱼等检测水污染,生物技术的发展在某种程度上是由商品经济 的发展所推动的。,Genentech公司1980年上市后20分钟内由35$涨到89$/股。,一、商业投资支持现代生物技术研究,第四节 基因工程技术的商业化发展,1980-1983年，美国成立了200多家生物技术公司。1985年400多

15、家，1300多家。 现在几乎每个大跨国公司（化学和制药）都投巨资。,二、基因工程商业化特点,1. 技术密集型,（1）产品来源于实验室,Boyer教授是Genentech的副总裁。,（2）科学家往往就是公司的领导人,1994年仅美国的总销售额40多亿美元。 1992年日本4000亿日元。 20世纪末6000亿美元。,2. 市场扩张迅速,美国1993年40多亿美元。 日本1997年5000多亿日元。 80年代初，加拿大联邦政府出资参与建立的Allelix生物技术公司，注册资本高达一亿美元！,3. 投入巨大,4. 风险太高,前期的资金投入是极其巨大的，非一般企业所能承受。,我国在“七五”和“八五”计

16、划的10年间，仅就“基因重组人生长激素”一个项目的研发就先后投入了近1.5亿元人民币的经费。这仅仅是一个仿制型的二类新药，而且又仅仅是制药工艺的研发。长达10余年的研发过程，巨额资金的投入，最终也并未获得高质量的“国产二类新药”。,全世界只有不超过100家生物技术公司有自己的产品。其中真正盈利的公司很少。,制药，动物胚胎移植技术，转基因动植物，农作物新品种等。,已取得的成果中60%是医学领域的。,7. 医学生物技术产业进展最快,6. 研究专一、产品专一,8. 专门为基因工程实验提供研发试剂的公司,5. 产品不断增加,基因工程的基本步骤,目的基因的获得,载体的提纯,重组载体的构建(酶切/连接）,转化/转染细胞的筛选,宿主细胞的转化/转染,宿主细胞的培养,目的基因的诱导表达,基因工程不是发现，而是创造。,基工的魅力,只 有 想 不 到 的,没 有 办 不 到 的,