色谱分析毛细管电泳.ppt

1、,Finding Whoa at Office 2.0,1,毛细管电泳,第七章,capillary electrophresis,概述毛细管电泳分离的一般过程毛细管电泳分离的基本原理基本概念毛细管电泳的分类毛细管电泳分离方式毛细管电泳柱技术毛细管电泳进样和检测技术,概述,毛细管电泳capillary electrophresis, CE，高效毛细管电泳high performance capillary electrophresis, HPCE以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性(电荷、大小、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等)为根据的液相微分离分析技术。,1981，

2、75m内径的毛细管，高电压1984，毛细管胶束电动色谱1987，毛细管等电聚焦1988-1989，CE商品仪器1989，第一届国际毛细管电泳会议,概述毛细管电泳分离的一般过程毛细管电泳分离的基本原理基本概念毛细管电泳的分类毛细管电泳分离方式毛细管电泳柱技术毛细管电泳检测技术,萃取、沉淀、结晶升华蒸馏过滤降沉、离心色谱电泳筛分,一、分离的一般过程,差速运动过程,二、数学描述差速运动过程L = v tRtR = L/v,三、基本原理高压电场为驱动力, 样品中各组分之间淌度和分配行为的差异，而实现分离的液相分离技术基本构造 高压电源、毛细管、柱上检测器和缓冲液贮瓶,毛细管 数据处理 电极 检测器 电

3、极 试样 缓冲液 缓冲液 高压电源 （可高至30KV）,基本构造 高压电源、毛细管、检测器和缓冲液贮瓶,高灵敏度，10-13-10-15 mol高柱效分析速度快，几十秒进样量少，纳升成本低应用范围广,优点,基本概念,电泳 electrophoresis 是指在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向所带电荷相反的方向发生迁移的电动现象。电渗 (eletroosmosis) 是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。淌度(mobility)是指带电粒子在单位电场下的移动速度。,带电粒子在电场作用下于一定介质中所发生的定向运动电泳淌度(ep):单位电场 (E)下的

4、电泳速度( ) ep= ep /E ep = ep (L /V) = ( l / t )(L /V),电泳,l :毛细管有效长度，,t:迁移时间,L:毛细管总长度,V:电压,电渗流electroosmotic flow, EOF pH 3时，石英毛细管内壁带负电荷，吸引溶液中的阳离子形成双电层，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，带动溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流电渗淌度(eo)eo =eo / E = l /( teoE ) 电渗流速度 毛细管有效长度 电渗流流出时间 电场强度,电渗 eletroosmosis,填充柱气相色谱,毛细管柱气相色谱,纯电泳状态,电泳过程中，伴随着电渗现象电渗流的

5、速度比电泳速度快57倍带电粒子的迁移速度等于电泳和电渗流二者的矢量和利用电渗流在一次电泳操作中同时完成正、负离子与中性分子的分离分析,洗脱顺序是: 正离子 中性分子 负离子电渗流是毛细管电泳分离的重要参数,电渗流的意义,离子所带电荷 解离度 体积溶液的黏度,电泳的影响因素：,电渗流的影响因素：,介质的介电常数介质的黏度Zeta电位双电层厚度界面有效电荷密度介电常数,改变外加径向电场改变缓冲液成分和浓度改变缓冲液pH加入添加剂改变温度,改变电渗流的方法：,电渗流的影响因素：,介质的介电常数介质的黏度Zeta电位双电层厚度界面有效电荷密度介电常数,分离效率柱效可以用理论塔板数n表示 n = (ep

6、+eo) V /(2D) 理论塔板高度 H =L / n n = 5.54 (/ W)2 为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离 W为电泳峰的半高峰宽,分离度电泳中两峰的分离度（Rs），也称为分辨率，它表示了淌度相近的组分分开的能力，可表达为 Rs= （n 1/2/4）（ /平 ） :相邻两区带的迁移速度差 平:为两者的平均速度 /平:表示分离选择性 n:柱效 Rs = 2 (tm2 - tm1 ) / ( W1 + W2 ) tm1、tm2 分别为两个组份的迁移时间 W 为峰底的宽度,影响分离效率的因素 ：焦耳热 进样电泳扩散毛细管壁对组分的吸附,焦耳热,细内径（100m），粗外径的毛细管

7、柱,进样 试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。 细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。 一般进样区带控制在柱长的1%电泳扩散 试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。,毛细管壁对组分的吸附 电泳峰拖尾或变形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：使用极端pH条件加入中性盐或两性离子化合物对毛细管内壁进行涂层处理 需要注意：方法也会抑制或改变电渗流,概述毛细管电泳分离的一般过程毛细管电泳分离的基本原理基本概念毛细管电泳的分类毛细管电泳分离方式毛细管电泳柱技术毛细管电泳检测技术,Zeta电势-,与固液界面的双电

8、层有着密切的关系CE所用的石英毛细管，pH值大于3时，内表面带负电，和溶液接触形成一双电层在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘,电渗流的意义电泳过程中，伴随着电渗现象电渗流的速度比电泳速度快57倍利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析电渗流是毛细管电泳分离的重要参数，控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。,带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流二者的矢量和。在典型的毛细管电泳分离中，若有电渗存在，离子的洗脱顺序是: 首先是最快

9、的阳离子，紧接着是依次减慢的阳离子，然后是全部的中性分子在一个区域出现，最后是最慢的阴离子，紧接着的是依次加快的阴离子。,eo正比于Zeta电势和介质的介电常数反比于介质的黏度Zeta电势正比于双电层厚度和界面有效电荷密度，反比于介质的介电常数改变外加径向电场改变缓冲液成分和浓度改变缓冲液pH加入添加剂改变温度,改变电渗流的方法：,Zeta电势,粘度,区带宽度及其展宽因素,区带宽度 Ws =（Wtl/tm）-Wd,时间宽度,检测器的窗口宽度,空间宽度,毛细管电泳capillary electrophresis, CE，高效毛细管电泳high performance capillary electrophresis, HPCE以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性(电荷、大小、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等)为根据的液相微分离分析技术。,缓冲液贮瓶,数据处理,毛细管,缓冲液贮瓶,样品,