1、多克隆抗体制备的技术孟琳,抗体的制备技术经历了三代：第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）；第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)；第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。,重组多克隆抗体,Sarantopoulos首次提出的。模拟了天然多抗的产生过程，克服了抗血清和单克隆抗体的缺点，成为治疗复杂疾病安全有效的制剂。技术：全人抗体库的构建 筛选和位点特
2、异性整和技术,多克隆抗体制备流程,（一）抗原的制备（二）免疫动物（三）免疫血清的收集（四）免疫血清的分离纯化,一、抗原的制备可以作为抗原的物质有很多种，一般的科研实验中，经常使用的抗原有：偶联多肽、偶联的小分子或化合物、天然或重组蛋白等等。对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。,细胞性抗原的制备,细胞破碎法：反复冻融法 冷热交替法 超声破碎法 自溶法 酶处里法 表面活性剂处理法,抗原的提取与纯化,提取：水溶液提取法有机溶剂提取法纯化：超滤，盐析，电泳，凝胶过滤，离子交换，亲和层析，高压液相法。,人工抗原,半抗原
3、+大分子载体=免疫原半抗原：相对分子量小，不具有免疫原性多肽，核酸，甾体激素，化学药物载体：天然蛋白质载体：人血清蛋白，牛血清蛋白. 合成类载体：人工合成的多肽聚合物,2.连接方法 半抗原与载体的连接有物理法和化学法。物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和CMC等；化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。,佐剂：弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant,IFA） 弗氏完全佐剂（complete Freunds adjuvant,CFA）初
4、次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时，一般不用完全佐剂，而采用弗氏不完全佐剂。但在研究分枝杆菌及相关抗原时，一般不用弗氏完全佐剂，以免卡介苗的干扰。,2. 佐剂的免疫生物学作用增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原；增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度；改变抗体类型，使产生抗体由IgMG型转变为IgG型；引起或增强迟发性超敏反应。,乳化作用,研钵乳化法直接在旋涡振荡器上乳化组织捣碎器乳化注射器乳化胶体磨,二、动物免疫,（一）免疫动物的选择 选择动物时应考虑以下因素：抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫
5、动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。抗原性质与动物种类,（二）免疫方法 根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等免疫途径：皮下注射 皮内注射 肌肉注射 静脉注射 腹腔注射以及淋巴结内注射,注射间隔时间：带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔 24 周免疫一次。不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为 12 周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可 5 天左右的间隔时间。,三、动物采血,采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。颈动脉采血法心脏采血法静脉采血法,四 抗体的分离和纯化技术,以理化性质提取均质的免疫球蛋白部分，去除无关蛋白。从免疫学角度提取与某特定抗原结合的特异性抗体。用吸附抗原的免疫亲和柱进行精细纯化。,纯化：盐析法 凝胶过滤法 离子交换层析法 亲和层析法 电泳分离法浓缩：吸收浓缩 蒸发浓缩 超滤浓缩,
