乳铁蛋白的分离工艺研究.doc

1、乳铁蛋白的分离工艺研究牛初乳是指奶牛产犊后 3d 内所分泌的乳汁。科学研究证实，牛初乳是自然界因子最为富集的生物资源之一。包括重要的免疫因子和生长因子，如免疫球蛋白（IgG） 、乳铁蛋白（LF ）及胰岛素生长因子（IGF）等，含量比常乳高 10100 倍。这些生理活性成分具有免疫调节、延缓衰老、促进生长发育、抑制肿瘤等生物功能，不仅可以制造功能保健食品，而且还具有开发天然活性生物药物的巨大潜力。乳铁蛋白又称“乳转铁蛋白 ”，是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族。LF 的一级结构是一条多肽链，分子量为 7080kD ，LF 上结合有两条糖链，含量为 7%左右，其组成包括有半乳糖、甘露糖、N乙酰半乳糖胺

2、、藻糖等。LF 具有多种生物活性，如促进铁的吸收、抑菌抗病毒、促进细胞增殖、调节骨髓细胞生成、调节补体系统、刺激溶菌酶再生、防止脂质过氧化等。在牛初乳中，乳铁蛋白的含量为 1.00mg/ml，比常乳高近 50 倍。我国约有乳牛近 430万头，其中成年母牛 260 万头，以每头乳牛年产初乳 50kg 计算，每年可产近 130t 乳铁蛋白，因此生产乳铁蛋白的原料极为丰富，它的开发利用将带来可观的经济效益和社会效益。但牛初乳具有异味及粘稠度大，难于加工处理的特点，除喂养牛犊之外，利用率非常低。初乳本身所具备的潜在价值得不到充分的反映。因此，高效综合利用牛初乳资源，开发出合理的分离技术路线以提取高纯度

3、、高活性的天然活性蛋白质，特别是开发生物药原料有十分重要的现实意义。本实验室通过离子交换色谱技术，成功地从初乳中分离出了高纯度的乳铁蛋白，并对此分离过程做了适当的优化，达到了低成本分离高纯度乳铁蛋白的目的。1 原料与器材1.1 原料与试剂牛初乳：乳牛产犊 3内收集的样品，CM-Sephadex C-50：进口分装BMK（Shanghai ）Sci & Tech Ltd，CM-SEPHAROSE FAST FLOW，LF 标准样品、电泳级丙稀酰胺 Acr、电泳级甲叉双丙稀酰胺 Bis、分析纯 Tris 碱（三羟甲基氨基甲烷） ，化学纯SDS（十二烷基磺酸钠） ，分析纯 TEMED（四甲基乙二胺）

4、 ，过硫酸胺 Ap，分析纯甘氨酸，考马斯亮蓝 R-250 等。1.2 实验仪器SBS-100 数控计滴自动部分收集器、HD-21-88 核酸蛋白检测仪、 3057 PORTABLE RECORDER、BT01-100 兰格恒流泵、TH-500 梯度混合器、 PHS-25 型 pH 计、DYY-8B 型稳压稳流电泳仪、DY 28A 型电泳槽、751G 分光光度计、 TDL-5000B 冷冻离心机。2 实验方法2.1 分离方法2.1.1 凝胶的预处理取液体胶与去离子水 1：1 混合，浸泡，沉降装柱。以 2BV 的流速先用碱洗 2.5h（5 倍胶体积） ，用去离子水洗至 pH 值为 7.0 左右，用

5、酸洗 2.5h，用水洗至 pH 值为 7.0 左右，再用碱洗 2.5h，后用水洗至 pH 值 7.0 左右备用。2.1.2 牛初乳的脱脂取新鲜牛初乳在冷冻离心机中离心 30min（4 800r/min，15 ） ，去上层油脂。2.1.3 阶跃洗脱的方法 在 4条件下动态上柱吸附 8h。去离子水以 1BV 的流速洗柱约 10h，待基线走平，用1.6%NaCl 洗脱约需 5h，期间杂蛋白被洗脱下来，待基线再度走平，使用 5.0%NaCl 洗脱，洗脱产物为 LF（粉红色） ，出峰时间为 1h 左右。洗脱曲线见图 1。2.1.4 CM-SEPHAROSE FAST FLOW 的穿透曲线（图 2） 在实

6、验中利用纯度为 97%标准样品配制浓度为 4.80g/l 的 LF 溶液，在约 5BV 流速下测定胶体积为 62ml 的 CM-SEPHAROSE FAST FLOW 的穿透曲线。根据洗脱记录可计算得到在穿透点到达前，CM-SEPHAROSE FAST FLOW 的实际吸附容量为 2g 左右。2.1.5 透析取洗脱液于透析袋，放在蒸馏水中 24h，中间每 8h 换一次水，除去洗脱液中的盐类小分子。2.1.6 干燥冷冻干燥法，此法对乳铁蛋白的生物活性损失小。2.2 分析方法2.2.1 蛋白质测定用核酸蛋白检测仪测定蛋白质。2.2.2 乳铁蛋白纯度的分析用 HPLC 法和凝胶电泳法进行纯度分析。3

7、 结果与分析3.1 交换剂的选择根据乳铁蛋白的特性，本实验选用弱酸性阳离子交换剂，并选用 Na 型交换剂作为贮存、吸附时的离子型。比较了 CM-SEPHADEX C-50 和 CM-SEPHAROSE FAST FLOW 2 种树脂的分离效果。 从表 1 可以看出，相同单位量的牛初乳原料进行实验，CM-SEPHADEX C-50 和 CM-SEPHAROSE FAST FLOW 相比，洗脱得到的 LF 的量和纯度都相差不大，只是 CM-SEPHADEX C-50 得到的洗脱液呈较深粉红色，而用 CM-SEPHAROSE FAST FLOW 洗脱得到的洗脱液颜色略浅一些。使用相同的装柱方法时，C

8、M-SEPHAROSE FAST FLOW 比 CM-SEPHADEX C-50 更容易操作，且在实验过程中体积不会发生变化，有利于实现工业化生产。同时由于装柱过程对洗脱效果也有相当程度的影响，故后继实验选用 CM-SEPHAROSE FAST FLOW 为交换剂。3.2 吸附方法的选择（见图 3） 离子交换色谱的吸附方法主要分为静态吸附与动态吸附 2 类。静态吸附需要的时间比较少，但是无法实现连续操作，只能停留在实验室小规模提取阶段，缺乏工业化生产的可能性。而动态吸附比较容易实现产业化，需要的时间一般随原料的量而变化。2 种吸附方法在后期的 pH 值基本保持稳定，说明牛初乳具有良好的缓冲功能

9、。由于静态吸附后的吸附剂难于装柱，故选用动态吸附法。3.3 吸附速度的选择由于在工业化生产中为了提高生产效率，必然在不影响产品得率的前提下降低生产周期。而牛初乳的上柱吸附时间在整个生产环节中占了很大的一个比例。尽可能的提高牛初乳的吸附速度成为工业化生产的必然选择。由于吸附速度受牛初乳的理化性质及离子交换柱的径高比等因素的影响，本实验只在现有条件下比较了 3 种不同吸附速度的效果比较。从表 2 我们可以看出 3BV 和 5BV 两个吸附速度的产品得率相差不大，7BV 的收率偏低，估计已超过穿透速率。故选用 5BV 的吸附速度。 3.4 洗脱方法的选择洗脱方法中，最常用的是阶跃洗脱与梯度洗脱法。2

10、 组梯度洗脱实验，分别使用5%NaCl 以及 10%NaCl 的浓缩液，稀释液均为去离子水。 表 3 中可以看出，阶跃洗脱的效果要好于梯度洗脱。从洗脱曲线上（见图 4、图 5）可以看出，梯度洗脱的梯度没有掌握好，峰都重叠在了一起，没有达到要求的分离度。可能是梯度太小，从而流动相的浓度增大，速度太小，峰型过宽，影响了最终的分离度。从洗脱曲线上也可看出，随着梯度洗脱的梯度的增大，峰型变得窄一些和陡一些，洗脱效果也有所提高。3.5 产品的透析和冻干（见图 6、图 7）洗脱液经透析 24h 后冷冻干燥，得 LF 固态产品。 4 结论本文主要对牛初乳中乳铁蛋白 LF 分离纯化的工艺进行了研究，并对其工艺流程实现了优化。得到最佳洗脱工艺：使用 CMSAPHAROSE FAST FLOW 装柱，再转化为 Na 型，然后用脱脂牛初乳作为原料，用 200 目滤布过滤后，在 4 下以 5BV 动态吸附上柱。吸附完毕后，先用去离子水以 1BV 的流速洗柱，约 10h，待基线走平，然后用 1.6%NaCl 以 1BV的流速洗脱，约需 5h，期间杂蛋白被洗脱下来，待基线再度走平，使用 5.0%NaCl 以 1BV的流速洗脱，洗脱产物为 LF（粉红色溶液） ，出峰时间为 1h 左右，洗脱液经透析后冷冻干燥得 LF 产品，纯度达到 95%以上。