分子生物学结课论文.doc

1、基因编辑技术的研究进展摘 要 ：基因组编辑是建立在基因靶向修饰的基础上，对生物基因组进行改造的一项新技术。通过利用人工核酸酶 ZFn、TALEN 和细菌获得性免疫系统 CRISPR，可在靶位点制造 DNA 双链切口进而诱导细胞内源性修复机制，通过同源重组修复或非同源末端连接途径实现基因敲除、替换和纠正。对目前 3 个主要的基因编辑技术的应用和发展作一综述。关键词 ：基因编辑；锌指核酸酶；TALEN；CRISPR/Cas9Abstract: Genome Editing is built on the basis of gene-targeted modification of the geno

2、me of a new bio-technology transformation. Through the use of artificial nucleases ZFn, TALEN and acquired immune systems bacterial CRISPR, can be manufactured at the target point and then induced DNA double-strand incision endogenous repair mechanisms within the cell, connected way to achieve gene

3、knockout by homologous recombination and non-homologous end repair In addition, the replacement and correction. Application and development of the current three major gene editing techniques are reviewed.Keywords: Gene Editing; Zinc finger nuclease; TALEN; CRISPR / Cas9.引言：21 世纪以来，科学家一直在寻求更加精确的方法对特定

4、的基因进行敲除或者靶向修饰。20 世纪 80 年代，研究者们可以利用同源重组的方法来对特定的基因进行靶向修饰，但由于自然重组的过程非常罕见，所以，这种方法效率非常低，只能达到 10-6。之后的研究发现，真核细胞的染色体发生双链断裂时，细胞会通过 DNA 同源重组或者非同源末端连接机制修复双链断裂 1，在修复过程中会出现高几率的基因缺失、插入和改变。所以，利用各种方法在染色体上的特定位点进行精确切割诱发 DNA 损伤修复，使得对真核生物进行精确的基因操作成为可能，以此实现特定细胞组织的遗传操作 7。2011 年，人工核酸酶介导的基因组编辑技术被 Nature Methods 杂志评选为年度最受关

5、注的技术成果。这 3 种酶包括有 3 个主要的类型 锌指核酸酶 (zinc finger nucleases, ZFn) 、转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases,TALEN)，以及归巢核酸内切酶 (meganuclease) 5。本文主要通过这三种物质来介绍基因编辑技术的进展。1 基因组定点编辑技术的初现锌指核酸酶 (zinc finger nucleases)1.1 锌指核酸酶的结构及作用原理锌指 (zinc finger, ZF) 是一种常见的 DNA 结合蛋白结构基元，每个锌指可直接特异识别 DNA

6、双螺旋中 3 个连续的核苷酸。人工串联 36 个识别不同靶位点序列的重组锌指结构，能够与靶序列特异性结合1。将多个锌指串联形成的 ZFP 结构域与 IIs 型限制性内切酶 FokI 的切割结构域相连接，就可构建成锌指核酸酶 (ZFn)，实现对靶序列的切割。增加串连锌指的数目可识别更长的靶序列,同时也就增加了 DNA靶向修饰的特异性 8。由于 FokI 需要二聚化来切割 DNA，所以，设计好的两个互补的 ZFn 分子同时与靶位点结合，当两个互补的 ZFn 分子间相距恰当的距离时(68 bp)，FokI 结构域将二聚化并切割 DNA，从而可特异性地在基因组特定位点切断 DNA 形成“双链断裂缺口”

7、 。双链断裂可以启动细胞内的 DNA 损伤修复机制，一方面细胞通过错配率很高的“非同源重组末端连接”机制修复双链断裂，从而在 ZFn 靶位点造成随机性的小片段丢失或是插入，引起基因的靶向敲除；另一方面，由于双链断裂使得同源重组效率大大提高，如果细胞内同时存在与靶位点同源的 DNA 片段，则细胞主要通过 DNA 同源重组的机制修复双链断裂，从而实现靶基因敲除或敲入。1.2 ZFn 的应用21 世纪初期，ZFn 技术在基因编辑中逐渐得到广泛的应用。该方法已经在黑腹果蝇、斑马鱼、大鼠、小鼠、拟南芥等模式生物的中成功实现了靶基因的敲除或定点修饰。2005 年，Urnov 等 8 首次利用 ZFn技术对

8、培养的人类细胞进行了基因敲除；2007 年，他们又利用 ZFn 介导的同源重组对人类细胞进行了基因定点插入；随后，人们相继在多种类型的人类细胞中，利用 ZFn，采用多种方案实现了多个基因的遗传修饰。ZFn 技术介导的基因突变使得一些遗传疾病的治疗成为可能。在艾滋病治疗方面，Sangamo 公司的 Holmes 等尝试使用 ZFn 技术破坏 CD4+ T 细胞中的内源基因 CCR5，可以使 HIV 病毒失去其重要的受体位点之一，从而抑制病毒的繁殖与传播 7。目前，Sangamo 公司针对 CCR5 设计的 ZFn 药物已进入三期临床试验阶段。但是，ZFn 在遗传疾病治疗方面的使用还需谨慎，脱靶切

9、割和试剂安全性方面的问题是亟需克服的。1.3 ZFn 的优势和局限ZFn 的出现使得基因打靶效率能够达到 30%左右，比被动的同源重组有了质的提升，并且已经可以做到针对某些特定的序列来设计 ZFn 实现靶基因的修饰，但也有其发展的局限性，ZFn 的识别结构域中存在上下文依赖效应，使得 ZFn 设计和筛选效率大大降低，所以目前尚无法实现对任意一段序列均可设计出满足要求的 ZFn，也无法实现在每一个基因或其他功能性染色体区段都能够顺利找到适合的 ZFn 作用位点，并且在已经成功运用的 ZFn 的报道中，大多数研究者并不公布其 ZF 序列 7。所以，在 ZFn 的筛选和设计方面还存在较大技术困难，如

10、何构建高特异性的 ZFn 将成为这个技术未来发展的重点。另外，由于 ZFn的脱靶切割会导致细胞毒性，使得其在基因治疗领域的应用出现了一定的局限性。目前，只能通过特异性的启动子在一定范围内调控 ZFn 的表达时间及表达量以减少脱靶切割，未来如何筛选更合适的启动子或者调控方式来降低脱靶切割是 ZFn 应用中应当克服的一个难题。2 基因编辑技术的发展TALEN2.1 TALEN 的结构及作用原理ZFn 的发明使得精确的基因组编辑成为可能，但是由于其对 DNA 序列识别的不规律性使得自身的发展受到局限。2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas) 中发现一种转录激活子样效应因子T

11、ALE5，该因子能特异性地结合 DNA。利用该特点，科学家们构建出另一种核酸酶 TALEN，用于基因编辑。通过 TALE 识别特异的 DNA 序列，FokI 二聚化产生核酸内切酶活性，与 ZFn 一样在特异的靶DNA 序列上产生双链断裂以实现精确的基因编辑。对目前发现的所有 TALE 蛋白分析发现，除了第 12 和13 位氨基酸可变外，其他氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基 (repeat variable diresidues,RVD) 9。TALE 特异识别 DNA 的机制在于每个重复序列的 RVD 可以特异识别DNA 的 4 种碱基中的 1 种，目前发现的

12、 5 种 RVD 中，组氨酸 - 天冬氨酸特异识别碱基 C；天冬酰胺-异亮氨酸识别碱基 A；天冬酰胺 -天冬酰胺识别碱基 G 或 A ；天冬酰胺-甘氨酸识别碱 T；天冬酰胺- 丝氨酸可以识别 A、T、G、C 中的任一种。而通过对天然 TALE 的研究发现，TALE 蛋白框架固定识别碱基 T，所以靶序列总是以碱基 T 开始。因此，理论上可以根据实验目的对 DNA 结合域的重复序列进行设计，得到特异识别任意靶位点序列的 TALE。2.2 TALEN 的应用TALEN 的发明使基因组编辑的效率和可操作性得到了提高，对于目的片段的切割效率达到了近40%。目前，TALEN 也像 ZFn 一样，被应用到了

13、不同种的细胞及生物的基因组编辑中。至今为止，研究者们已经应用 TALENs 对果蝇、蛔虫、斑马鱼、青蛙、大鼠和猪等模式生物 7进行了基因组定点编辑 11。而使用 TALEN 技术对牛、蟋蟀和家蚕等非模式生物进行内源基因的定点修饰也有报道。在目前的研究中，大多数研究者都使用一对 TALENs 对目标基因进行敲除，也有一些报道同时使用了两对 TALEN 对同一条染色体上的两个位点进行敲除，使基因组缺失更大的片段。同样的，也已经有研究者利用 TALEN 和同源片段的引入实现了在斑马鱼和人的基因组中进行定点插入 10。在各种遗传疾病的治疗方面，TALEN 技术的高精确性使得对这些错误基因的修饰比 ZF

14、n 更具潜力。Mussolino 等利用 TALEN 和 ZFn 两个技术对人胚肺 293 细胞的 CCR5 及 CCR2 位点中 19 bp 的靶序列成功进行了定点敲除，且 TALEN 的脱靶切割几率比 ZFn 要低得多。Sun 等利用设计的一对 TALEN 和同源性序列成功地对缺陷型 珠蛋白基因进行了更改，使其恢复到正常序列。2.3 TALEN 的优势和局限相比 ZFn 技术，TALEN 使用了 TALE 分子代替 ZF 作为人工核酸酶的识别结构域，极好地解决了 ZF 对于 DNA 序列识别特异性低的问题。TALE 蛋白与 DNA 碱基是一一对应的，并且对碱基的识别只由 2 个氨基酸残基决

15、定，这相对于 ZFn 的设计要简单得多。但是在构建过程中，TALE 分子的模块组装和筛选过程比较繁杂，需要大量的测序工作，对于普通实验室的可操作性较低，而商业化公司构建也需要花费上千美元，使用成本较高；并且，TALEN 的蛋白质相对分子质量要比 ZFn 大得多，过大的蛋白质分子往往会增加分子操作的难度，去除 TALEN 分子的不必要结构或者缩短识别序列的长度能一定程度地减轻影响，但是却有可能造成识别特异性降低而导致脱靶切割，引起细胞毒性。3 基因组编辑技术的新方向CRISPR/Cas93.1 CRISPR/Cas9 系统的结构及作用原理TALEN 对于靶序列识别的精确性使得该技术在近 3 年来

16、得以飞速发展，但是其构建复杂，并且较大的相对分子质量在某些情况下使用困难也制约了其应用前景。自 2002 年以来，CRISPR 一直以其奇特的结构与特殊的功能吸引着各国科学家们的共同关注。它的结构非常稳定，长度约 2550 bp 的重复序列(repeats)被间区序列(spacers) 间隔。2005 年，Cas 系统(CRISPR-associated sequences system, CASs) 被发现在原核生物中表现出某种获得性免疫功能 2，能使宿主获得抵抗噬菌体、质粒等外来 DNA 入侵的免疫能力。CRISPR/Cas 系统的作用机制大体可分为 3 个不同阶段：在噬菌体侵入的起始阶段

17、， Cas 蛋白复合物靶向裂解噬菌体基因组中短的原型间隔序列， 这些原型间隔序列整合到宿主基因组中 CRISPR 位点的 5端 ；然后这些短的掺入的间隔序列被转录成 crRNAs ；当宿主再被噬菌体感染时，crRNAs 作为模板通过 Cas 复合物靶向降解噬菌体 DNA。CRISPR 系统大致分为 3 类，其中 I 型及 III 型 CRISPR 系统由复杂的 Cas 复合物介导 DNA 或 RNA 的降解，而在产脓链球菌 (Streptococcus pyogenes)中发现的 II 型 CRISPR 系统组分较为简单，只需要 Cas9 和两个非编码 RNA，3 个组分即可介导外源 DNA

18、片段的靶向降解，所以目前针对 CRISPR/Cas9 研究较多。在 CRISPR/Cas9 系统中，外源的 DNA 进入细胞内，细菌的 RNaseIII 催化 crRNA 的成熟，成熟的 crRNA 通过碱基配对与 tracrRNA 结合，形成双链 RNA 构 3。这一 crRNA: tracrRNA 二元复合体指导 Cas9 蛋白在 crRNA 引导序列靶标的特定位点剪切双链 DNA，在与 crRNA 引导序列互补的位点，Cas9 蛋白的 HNH 核酸酶结构域剪切互补链，而 Cas9 RuvCI 结构域剪切非互补链。 3.2 CRISPR/Cas9 系统在基因组编辑中的应用利用 CRISPR

19、/Cas9 系统对 DNA 分子的靶向切割特性，使其可以被用于定向的基因修饰。2012 年，来自加州大学伯克利分校的 DouDNA 研究小组首先利用人工设计的 crRNAs 序列，使用产脓链球菌的CRISPR/Cas9 系统对体外的 DNA 靶序列进行了精确切割，并且把 crRNA:tracrRNA 二元复合体改造为单链 RNA 嵌合体，也能同样指导 Cas9 蛋白在特定位点剪切双链 DNA 4；之后，又有报道分别证明了通过人为设计可以利用产脓链球菌的 CRISPR/Cas9 系统在大肠杆菌细胞对外源噬菌体的双链 DNA 及外源质粒进行精确地定点切割。2013 年初，来自 MIT 的 Zhan

20、g Feng 研究小组证明了经过修饰的产脓链球菌 Cas9 蛋白可以在 crRNA:tracrRNA 的指导下对 293FT 细胞的特定位点进行精确地切割，他们同时发现对 Cas9 蛋白的 RuvC I 结构域进行修改之后， Cas9 对目标基因进行单链的切割在人源细胞中同样可以实现。而且，CRISPR/Cas9 系统可以通过设计多段 crRNA 来对同一个细胞的多个位点进行切割。来自哈佛的 Church 研究小组同期的实验也利用了 CRISPR 方法 293T、K562 以及 iPS 细胞进行了精确的基因编辑。之后又有 3 个不同的研究小组也利用了 CRISPR/Cas9 系统对人、小鼠和斑

21、马鱼细胞同样进行了精确的基因组编辑。CRISPR 对靶位点的切割效率被证明与 ZFn 和 TALEN 相差无几，但是对不同序列的切割效率却存在着差别，不过其脱靶切割的几率相比前两种方法要低的多。总而言之，CRISPR/Cas9 应用于基因组编辑还处于初期阶段，但它的确为基因组编辑提供了一个新的思路，在将来的发展中具有极大的潜力。3.3 CRISPR/Cas9 系统的优势和局限相较于 ZFn 和 TALEN 两种人工核酸酶技术， CRISPR/Cas9 系统是一个天然存在的原核生物 RNA 干扰系统，其介导的基因组编辑是由 crRNA 指导的，对靶序列的识别是 RNA 与 DNA 的碱基配对过程

22、，相比蛋白质对 DNA 序列的识别要精确更多，只要有一个碱基无法配对，就不会实现 Cas9 对 DNA 的切割，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。而且，CRISPR/Cas9 系统是由 RNA 介导的 DNA 切割，若在 RNA 水平上进行分子操作，则可实现精确且瞬时的切割，在切割时间的调节上相较于 ZFn 和 TALEN 容易得多。但是，CRISPR/Cas9 系统在真核基因组编辑中也存在着一些不足。首先，Cas9 蛋白对于目标序列的切割不仅仅依靠 crRNA 序列的匹配，在目标序列 (protospacer) 附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序 ( protospacer adja

23、cent motifs, PAM)，如果目标序列周围不存在 PAM ( 目前证明 PAM 序列为NGG) 或者无法严格配对，则 Cas9 蛋白不能行使核酸酶的功能，这也造成了利用 CRISPR/Cas9 不能对任意序列进行切割。其次， CRISPR/Cas9 系统所靶向的序列仅需十余个碱基对精确配对，这可能降低 CRISPR/Cas9 系统切割的特异性 6。并且，作为一个原核的系统，针对真核细胞中染色体的各种修饰结构是否能够无差别地进行高效切割也需要进一步探究。最后，和 ZFn 及 TALEN 技术一样，CRISPR/Cas9 也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能随机产生细胞毒

24、性的问题，这在将来的研究和应用中也亟待解决。4 未来展望随着越来越多不同物种的基因组完成测序 , 解读基因组的功能显得日益重要。基因组靶向修饰是进行基因组改造与基因功能研究的一个重要手段。ZFn 技术首先为精确的基因打靶打开了大门，但是其对于DNA 序列的识别特异性较低，容易造成脱靶切割引起细胞毒性，使得该技术在应用领域的发展受到限制。TALEN 技术使用了转录激活子样效应物 (TALE) 代替了 ZF 作为 DNA 识别结构域，原理上能够一一对应不同的碱基而精确识别靶序列，克服了 ZFn 脱靶切割的问题，使得精确地基因组编辑技术得到一个推进，但是它仍然存在和 ZFn 一样构建复杂及使用成本高

25、的问题 11。利用细菌和古细菌的获得性免疫系统 CRISPR 进行基因打靶是基因组编辑的一个新兴技术，该技术巧妙地利用了原核生物非编码 RNA 介导的DNA 干扰来对目的序列进行精确切割，这种方法具有精确性高、系统构建简单和使用成本低、能同时对同一细胞多个位点进行切割等优势，但是这个技术的应用目前还处于细胞水平。并且，这一原核系统在面对真核系统复杂的染色体结构时，究竟能否有效切割，现在还不得而知。目前，以上 3 种方法的应用多是借助 DNA 的非同源末端连接，而利用 DNA 同源重组修复介导序列的插入、置换或修饰的成功案例则较少。在将来的发展中，如果能够提高同源重组的几率以实现高效率的定向基因

26、修饰，则能够在遗传疾病治疗和动植物转基因筛选优良品种或构建生物反应器等方面得到应用。总而言之，以上几种基因组编辑技术目前还处于研究的初期阶段，但其在基因操作方面已表现出巨大的潜力和广阔的应用前景，将对医学和生物学产生深远的影响。参考文献(References)1张智辉,董少忠,寸韡,等. 基因组定点编辑技术的研究进展 .生命科学，2013,25(7): 735-7392方锐,畅飞,李宁,等.CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术.生物化学与生物物理进展,2013,40(8):691-7023颜雯,李海涛,等. CRISPR/Cas9 基因组改造技术研究进展.广东农业科学,2014,2

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