1、实验七 动物组织中核酸的提取和鉴定【原 理】动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用 95乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用 10NaCl 溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖） 。此三类化合物可用下列方法鉴定之。1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常
2、用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素 C 等。H3PO412H 2MoO4H 3PO412MoO3 + 12H2OH3PO412MoO3 H3PO46MoO3 3Mo2O52、嘌呤碱：能与苦味酸作用形成针状结晶3、戊糖：(1)核糖：经与强酸(盐酸与硫酸)共热生成糠醛，后者可与 3;5 二羟甲基苯缩合成绿色化合物。(2)脱氧核糖：在强酸中加热，可生成 羟基 酮基戊醛，后者再与二苯胺作用生成一蓝色化合物。上述二反应如下【操 作】(一)核酸提取l、用酚提取法：（1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水 3ml，继续研磨约三分钟。（2）于该研钵中再加
3、酚液 5ml，研磨约十分钟后，倒入-圆底离心管中，离心 5 分钟（约 2000 转/分钟） 。（3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚 2ml，用拇指将管口按住，用力振摇 12 分钟(提出酚)，离心 5 分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。（4）于该管中加入 95乙醇 2ml，用玻棒搅拌约 2 分钟，离心 3 分钟，取出去上清液，沉淀部分即为核酸。2、用三氯醋酸提取法（1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏 4ml 比例加入 1三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆 5ml 于带塞离心管中，3000 转分离心 5 分钟。（2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加 95乙醇 5ml
4、 充分混匀，在水浴中加热至沸 2 分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。（3）倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入 10NaCI 溶液 4ml，置沸水浴中 8 分钟，并用玻棒不断搅拌，取出；冷却后再离心，（4）将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。取等量 95的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白色沉淀逐渐出现，静置 10 分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中，离心 5 分钟，将上液倾去，所得白色沉淀即为核酸钠。(二)核酸的水解：在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水 2ml。振摇至沉淀溶解后，加入 10H 2SO42mL 摇匀，于沸水
5、浴中加热 10 分钟，即得核酸水解液，用流水冷却后进行下列定性试验。(三)鉴定：l、嘌呤碱的鉴定：取中试管一支，加入饱和苦味酸约 2ml，再加入核酸水解液 46 滴，摇匀。静置于室温中，观察有无黄色针状结晶出现， 。2、脱氧核糖的鉴定：取中试管 2 支，标号、按下表操作：管 号试 剂 核酸水解液 5%硫酸 二苯胺试剂1（测定管） 24 滴 30 滴2（对照管） 24 滴 30 滴摇匀，于沸水浴中加热 15 分钟后，观察二管颜色之变化。3、核糖的鉴定：取中试管 2 支，标号，按下表操作：管 号试 剂 核酸水解液 5%硫酸 拜耳氏试剂1（测定管） 6 滴 9 滴2（对照管） 6 滴 9 滴摇匀，于
6、沸水浴加热 10 分钟后观察色颜色之变化。4、磷酸的鉴定取中试管二支，标号、按下表操作：管 号试 剂 核酸水解液 5%硫酸钼酸试剂 3%维生素 C1（测定管） 10 滴 5 滴 4 滴2（对照管） 10 滴 5 滴 4 滴摇匀，于沸水浴中 23 分钟后，观察二管颜色之变化。【试剂配法】1、饱和苦味酸溶液：称取 1.3 克的苦味酸，溶于 100ml 的蒸馏水中，静置过夜。临用前倒取上层液。2、钼酸试剂，称取钼酸铵 5 克，溶于 100ml 蒸馏水中，再加入浓硫硫 15ml 待冷却后加蒸馏水至 1000ml，此试剂可置阴凉处保质一月。3、拜耳（Bial）氏试剂：称取 1.5 克 3，5 一二羟甲苯
7、，加入浓盐酸 50ml。再加 10三氯化铁 2030 滴，贮于冰箱。此试剂应在临用前配制。4、二苯胺试剂：称取纯二苯胺 lg 溶于 1000ml 的冰醋酸中，加入浓硫酸 2.75ml，贮于棕色瓶中，此试剂亦需临用前配制。5、3维生素 C：称取维生素 C 3 克溶于 5三氯醋酸 100ml 中（已氧化变质的维生素 C 不能用） 。【注意事项】1、在用饱和 NaHCO3调节 pH 值时，一定用试纸测定，将 pH 调节在 6.5 以下。2、肝匀浆一定要磨得较细，细胞彻底破坏。【实验报告与思考题】1、核酸提取、鉴定的原理如何？2、在本实验的操作过程中应注意什么问题？3、DNA 和 RNA 在组成上有什么区别？如何鉴别？
