分子荧光课件.ppt

1、第四章,分子荧光分析新技术,4.1 分子荧光光分析法概论,一定量分析 A =-lgT =bc T = F ( ) F =f 若用级数展开，略去高次项，得F = 2.303f kC k = bf称为荧光的量子产率，f,二影响发光强度的因素 f =,S*,S,kc,kf,kx,T,kp,kc,讨论1.kf主要取决于分子结构，受环境影响较小。 max 可作为kf的定性度量 max大，A大，kf大 例如 * n* 具有多重共轭双键的分子发射的荧光较强,2. kc受环境影响最为强烈(无辐射去活速率常数） T升高，分子碰撞的几率增加，kc变大 3. kx为内交联的速率常数 kx既受分子结构的影响，也在一定

2、程度上受环境的 影响。 kx：（1）对*n，kxkf 对*，kxkf （2）溶剂的极性影响分子跃迁类型 喹啉在苯中 *n 在极性S *,喹啉在苯、乙醇、水中的f分别为1，30，1000 (1) kx依赖于S*T的距离 距离越小，kx越大(2) 重原子效应 在含有轨道上的分子引入重原子之后，kx变大 氟苯 f 0.16 氯苯 f 0.05 溴苯 f 0.01 碘苯 f 0(3) 不成对自旋的顺磁物质，也发现会增大系内交联速率 例如：锌卟啉二甲酯螯合物具有中等强度的荧光和磷光, 铜卟啉二甲酯螯合物的荧光减弱，磷光增强,三分子发光与结构的关系 要使分子产生荧光，则分子结构能吸收UV-Vis辐射, 且

3、要有较高的荧光效率。(1)若分子吸收UV-Vis辐射能力越强，发光越 强；(2)能强烈发光的分子几乎都是经过* 跃迁，具有共轭双键、刚性较强的平面和 多环结构的分子易于发光。,取代基对分子发光有显著影响（1） 给电子基团常使荧光增强 如NH2，OH（2） 吸电子基团使荧光减弱或熄灭 如COOH，NO2，NN 刚性强的分子f大 如环的封闭作用使分子刚性增强 芴 f 1.0 联二苯 f 0.2 有机螯合剂与金属离子形成配键时， 刚性 增强 8-羟基喹啉与Zn f 8-羟基喹啉 f,四仪器,与UV-Vis的区别： 1.检测方向与入射方向垂直，以便使被散射的入射光的直接检出减至最少2.两个单色器 3.

4、检测池四面透明 4.激发光谱 5.发射光谱,L,M1,S,M2,D,R,五溶液荧光的熄灭 荧光的熄灭广义的包括了任何可使荧光增强度降低的作用。狭义的仅仅指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的现象，这些会引起荧光的熄灭的物质称为熄灭剂 。 狭义的荧光熄灭的原因是溶液中熄灭剂分子和荧光物质分子之间发生相互作用而引起荧光物质分子的荧光效率降低或荧光物质激发态的寿命缩短，从而导致荧光强度的降低。,著名的熄灭剂:卤素离子重金属离子氧分子硝基化合物,4.2 三维荧光光谱法 Total Luminescence Spectrometry,一般荧光法对复杂混合物荧光光谱

5、难以分辨，因而使它的应用受到限制。 F是ex、em的函数。 Total luminescence（TLS） Two-dimensional spectra（TDS） Topograms,一. 三维荧光光谱图的表示方法1. 三维投影图（isometric projection） 以em为x轴， ex为y轴，F为z轴而构成的三维投影图。 y轴由小到大 正面图 y轴由大到小 背面图 2. 等高线图（contour plats） 以em为x轴， ex为y轴，把荧光强度相等的点用线连接起来，则在平面上形成等高线图，称为等高线荧光光谱图。,二. 实验技术1. 一般的荧光分光光度计 分别测定各个不同激发波长

6、下荧光发射光谱，根据所得数据用计算机绘制三维投影图或等高线图。 此法非常麻烦，耗时。2. 电视荧光计（Videofluorometer） 电视荧光计使用快速扫描多道检测器，如光导摄像管在几毫秒内以矩阵的形式收集数据，光导摄像管的光敏表面可看成是几千个检测器的二维排列。,red,yellow,green,blue,UV,EmissionPolychromator,VIDICON,ex,em,ExcitationPolychromator,Sample,3. 光二极管阵列荧光计(The Photodiode Array Fluorenometer) 与二维光导摄像管检测器相比，光二极管阵列是一维检

7、测器。为了得到光二极管检测器，荧光分光光度计的光电倍增管和单色器必须被二极管阵列和多色器所取代。,三. 三维射影图和等高图的特点1. 三维投影图比较直观地观察激发发射波长对所对应的荧光强度的信息；2. 三维投影图难以用于相似样品的定量测定；3. 等高线图可用于相似样品的定量比较。,四. 生物医学应用1. 血清 TDS已经被广泛用于多环芳香碳氢化合物分析、液相色谱、细菌指纹、地球化学、煤化作用研究和光化学研究，在生物医学中的应用是较新的应用研究。,从血管直接抽取的血样称为全血。 全血经放置之后，自然分为两层，上层清析。称为血清(serum)。 全血加抗凝剂以后，放置一段时间后，也会分为两层，上层

8、的清液称为血浆(plasma)。 血浆比血清多一种胶原蛋白。,在他的进一步报道中，健康和具有肿瘤的小白鼠的可见荧光地貌图被报道，仅一个荧光峰被发现，暂时被认为是NAD(P)H(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的荧光所致，通过聚类分析荧光参数，可使具有肿瘤的小鼠与正常小鼠区分开来。,b. 人血清 人血清的总荧光光谱也可被分为紫外和可见两个区域。在紫外区的单一荧光峰是由于血清蛋白的强荧光峰所致，它的最大值为287/337nm，它与相同实验条件下色氨酸的荧光峰完全一致。由于蛋白质结合的色氨酸的荧光强烈地受环境的影响，因此血清宽的荧光峰可能是由于各种血清蛋白的荧光峰的加合。 Fig.5,在可见光区域观察到的

9、荧光峰可能是由下列物质所致： NAD(P)H (345/460nm) 蛋白质结合的吡哆醛磷酸盐(410/500nm) 蝶啶(360/425nm) 蛋白质结合的胆红素(460/515nm) 黄素Fig.6,(1)血清超滤液 血清超滤液的UV部分显示两个荧光峰，280/302nm，286/357nm，这是自由的Trp和Tyr所致，与全血样品相比，Tyr的荧光的小部分被传递给Trp，因此显示出它自己的荧光峰。当Trp，Tyr不被蛋白质结合时，Tyr和Trp相距较远。 在vis区域，血清超滤液的荧光因人而有较大的差异， NAD(P)H 和吡哆醛磷酸盐的荧光峰不可探测，这是因为在超滤中它们难以从它们的运

10、输蛋白中分离。,（2）病理学血清 因此各种内源代谢物的浓度在病理学血清中将会发生变化，因此在地貌学图中的偏差可用于临床分析。图显示了一个患有黄疸病的病人的topogram，胆红素的荧光峰强烈增加覆盖了其他所有的峰。 胆红素有两个峰值: 454/520nm，465/522nm。 在紫外区，发现正常人血清和癌症患者血清有显著的不同，这种差异可用癌症疾病诊断快速扫描方法。,2. 人尿 人尿的总荧光光谱可被分成三个光谱区域，显示了三到五个明显的荧光最大峰。由于尿中代谢物种类和数量受营养、性别和年龄的影响，因此与血清地貌图不同，尿液荧光地图因人而异。 （1）第一区 UV激发 290/380nm 吲哚代谢

11、物 325/420nm 维生素B6的代谢物 下列物质也可能有贡献: 3羟基2氨基苯酸 黄嘌呤 服用维生素B6 后使此荧光峰大大增强。,（2）第二区 可见光激发 荧光强度低于紫外激发 420/525nm 450/525nm 465/525nm 这些发射可能是由于： 核黄素或它的尿代谢物(7一羟基核黄素或8-羟基核黄素),（3）第三区 波长较长的可见光区荧光 荧光强度最低 尿中卟啉 400/600nm 400/650nm 此二峰与尿卟啉和粪卟啉的荧光峰完全相对应。 一些疾病与尿中荧光化合物的数量有关，尿液的总荧光光谱图可用于某些疾病的诊断。,论文题目： 总荧光光谱法在： 临床诊断中的应用 生物医学中的应用现状 液相色谱中的应用,