测定α-淀粉酶活力的方法.doc

1、实验五 激活剂、抑制剂、温度及 PH 对酶活性的影响一、目的要求 通过实验加深对酶性质的认识，了解测定 -淀粉酶活力的方法。二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有

2、些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约 30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和 PH 值称为某种酶作用时的最适温度和 PH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一 PH 范围内酶活力可达最高，在最适 PH 的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。食品级 -淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促

3、反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的 -1,4 糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称-淀粉酶为液化淀粉酶。-淀粉酶不能水解淀粉支链的 -1,6 糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和 -1,6 键的寡糖。本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于 6 个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪 -淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。三

4、、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响（一）试剂及材料1、1：30 唾液淀粉酶配置 用蒸馏水漱口，1min 后收集唾液，以 1：30 倍蒸馏水稀释。2、0.2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉 0.2g，预加 20mL 蒸馏水调匀，然后倒入 80mL 沸水中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至 100mL。3、1%NaCl 溶液 称取 1.0 g 氯化钠，加水溶解稀释至 100mL 。4、1%CuSO4 溶液 称取 1.0 g 硫酸铜，加水溶解稀释至 100mL。5、标准稀碘液 称取 11g 碘，22g 碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至 500mL。吸取 2mL 上述碘

5、液，加入 10 g 碘化钾，用水稀释至 500 mL。（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。（三）操作方法取试管 3 根，编号后按下表配置实验样液。试管序号0.2%可溶性淀粉1%NaCl 1%CuSO4 蒸馏水 1：30 唾液淀粉酶1 2.0 mL 1.0 mL / / 1.0 mL2 2.0 mL / 1.0 mL / 1.0 mL3 2.0 mL / / 1.0 mL混匀，放入37水浴中保温10min。立即加入唾液淀粉酶。1.0 mL用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。四、温度与 PH

6、值对 -液化淀粉酶活力的影响（一）试剂与材料1、2%可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉 2.0g（预先在 105烘干） ，预加 20mL 蒸馏水调匀，然后倾入 80mL 沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至 100mL。2、PH4.0 、5.0、6.0、7.0、8.0 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液（1）0.2 mol /mL Na2HPO4 称取 35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至 100mL。（2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的 PH 值。3、供试酶液的制备 称取固体 -液化淀粉酶 1.00g，加入 PH6.0 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液 100mL (缓冲液的加入量视酶活力大小而

7、定，控制酶解反应在 5-10min 内完成)，于40恒温水浴中活化 0.5 小时，然后用 3000rpm / min 离心机离心分离 5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。4、标准比色液 甲液：称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重铬酸钾 0.4748 g，溶解并定容至500mL。乙液：称取铬黑 T 40.00mg，溶解并定容至 100mL。使用时取甲液 40.0mL、乙液 5.0 mL，混合。混合比色液宜放置冰箱保存，使用 7 天后重新配置。5、标准稀碘液。（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。（三）操作方法1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终

8、点的标准色。2、不同温度对 -液化淀粉酶活力的影响 取 4 根 25200mm 试管，按下表配制反应溶液。试管序号 1 2 3 42%可溶性淀粉 20.0mL 20.0mL 20.0mL 20.0mLPH6.0 缓冲液 5.0mL 5.0mL 5.0mL 5.0mL把四根试管分别放入 50、60、70、80恒温水浴中预热 10min分别加供试酶液 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL50 60 70 80反应完成时间记录（min）加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2 滴反应液，滴入预先盛有 2/3 稀碘液的比色白瓷板孔穴内 ，从淀粉

9、遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。3、不同 PH 值对 -液化淀粉酶活力的影响 取 5 根 25200mm 试管，按下表配制反应溶液。试管序号2%可溶性淀粉 缓冲溶液 供试酶液 反应完成时间记录（min）1 20mL PH4.0 5.0 mL 0.5 mL3 20mL PH6.0 5.0 mL 0.5 mL4 20mL PH7.0 5.0 mL 0.5 mL5 20mL PH8.0 5.0 mL恒温水浴 60预热10min。 0.5 mL其它操作与温度对酶活力影响实验相同

10、。五、结果计算和讨论淀粉酶活力单位定义为 在一定条件下，1 g 酶制剂 1 小时内液化可溶性淀粉的克数。 酶活力单位(U/g)= nt5.0260式中：20可溶性淀粉的用量（mL） ；t酶解反应完成所需的时间（min） ；0.5测定时稀释酶液用量（mL） ；0.02可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL） ；n酶制剂稀释倍数1、不同温度对 -液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果 50 60 70 80酶活力（U/g）2、不同 pH 值对 -液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果 pH4.0 pH6.0 pH7.0 pH8.0酶活力（U/g）分别以 PH 值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制 PH 值酶活力单位、温度酶活力单位图。讨论分析实验结果。六、思考题1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？2、实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？3、进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？为什么？4、生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？5、酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？