1、蛋白质的等电点测定及性质实验一、实验目的初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，并了解蛋白质的性质。二、实验原理蛋白质分子是两性电解质，当调节溶液的酸碱度，使蛋白质分子上所带的正负电荷相等时，在电场中，该蛋白质分子既不向正极移动，也不向负极移动，这时溶液的 pH 值，就是该蛋白质的等电点（pI）。不同蛋白质，等电点不同。在等电点时，蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。因此，可以借助在不同 pH 溶液中的某蛋白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。蛋白质的盐析作用是可逆过程。由盐析获得的蛋白质
2、沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解。而重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。三、试剂和器材 高筋面粉、低筋面粉。 1mol/L 醋酸。 （每组自配 0.1mol/L 醋酸、 0.01mol/L 醋酸） 0.5%酪蛋白溶液。称取 2.5 克酪蛋白，放入烧杯中，加入 40的蒸馏水，再加入 50 毫升 1N氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转到500 毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。在容量瓶中再加入 1N 醋酸溶液 50 毫升，摇匀，再加蒸馏水定容至 500 毫升，得到略显混浊的、在 0.1N NaAc 溶液中的酪蛋白溶液。 鸡蛋白溶液。将
3、80mL 鸡蛋清与 800mL 蒸馏水混合均匀后，用洁净的多层湿纱布垫在漏斗上过滤，滤液即为鸡蛋白溶液（不能有不溶性物悬浮）。要现配现用，最好使用经过煮沸并封在容器中隔绝空气冷却的蒸馏水。 质量分数为 5%的 CuSO4溶液。 （每排 3 组合配） (NH4)2SO4饱和溶液。 （确保有固体析出） 天平、水浴锅、移液管、试管等。四、操作步骤1、蛋白质的等电点测定 取 5 支同种规格的试管，编号，按表 1 顺序精确加入各种试剂， 特别注意 0.5%酪蛋白溶液最后加入， 然后逐一振荡试管，使试管混合均匀。此时1、2、3、4、5 管的 pH 值依次为 5.9、5.3、4.7、4.1、3.5。 将上述
4、试管静置于试管架上 15min 后，仔细观察，比较各管的浑浊度，将观察的结果记录于表格内，并指出酪蛋白的等电点。注意：本试验各种试剂的浓度及用量均要求很准确，确保缓冲液的 pH 值准确；浑浊度可用、等符号表示，最混浊的一管的 pH 值即为酪蛋白的等电点。表 2-1 蛋白质的等电点测定表试管号 蒸馏水/mL 1mol/L 醋酸/mL 0.1mol/L醋酸/mL 0.01mol/L醋酸/mL 0.5%酪蛋白溶液/mL 浑浊度1 8.4 0.6 1.02 8.7 0.3 1.03 8.0 1.0 1.04 9.0 1.05 7.4 1.6 1.02、蛋白质性质实验 蛋白质的盐析在试管里加入 12mL
5、 鸡蛋白的水溶液，然后逐滴加入(NH 4)2SO4饱和溶液，观察现象（有无白色混浊产生）。滴加过程中不要摇动试管，现象不明显时，多加几滴硫酸铵饱和溶液。把少量混浊倾入另一支盛有蒸馏水的试管里，观察白色混浊是否溶解。 蛋白质的变性在试管里加入 2mL 鸡蛋白的水溶液，沸水浴加热 5min，观察现象。把试管里的下层物质取出一些放在水里，观察现象。把试管里加入 3mL 鸡蛋白的水溶液，然后加入 1mLCuSO4溶液，观察现象（有无淡蓝色絮状混浊沉淀产生）。把少量沉淀放入盛有蒸馏水的试管里，观察沉淀是否溶解。 蛋白质发泡性取 100mL 烧杯，装入 5mL 鸡蛋白的水溶液，插入 1mL 移液管，用吸耳
6、球不断鼓入空气 1min，观察发泡情况（泡沫数量、泡沫持续时间）。另取 100mL 烧杯，装入 5mL 蒸馏水，插入 1mL 移液管，用吸耳球不断鼓入空气 1min，观察发泡情况（泡沫数量、泡沫持续时间）。3、面粉中面筋的粘弹性 将 20g 高筋面粉加 9mL 水揉成面团（注意朝着一个方向揉捏）。另外将20g 低筋面粉加 9mL 水揉成面团（注意朝着一个方向揉捏），要求揉捏有力。 将上述揉捏好的面团静止 15min 以上。 将上述静置好的面团，用手握住，不断在水中揉洗（注意朝着一个方向揉捏）。直至没有淀粉洗出为止，即无白色液体流下。 将上述洗好的面团放置 60min 以上，使得表面水分挥发。 用手揉捏上述两个面团，观察两个面筋的粘弹性及拉伸成薄膜的情况，并进行对比。4、自主设计实验根据兴趣爱好，3-6 位同学为一组，查找相关资料，开展趣味自主设计实验，或者对在本实验基础上，进行扩展实验。五、实验要求1、记录各实验结果并解释相关实验现象。2、在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？3、当实验结果与已知发生较大误差时，试着分析其原因。
