1、生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量实验日期 实验地点合作者 指导老师评分 教师签名 批改日期1、实验目的1.1.学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法；1.2.了解电泳技术的一般原理；1.3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。二、实验原理2.1.血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于 pH7.4。它们在 pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Album
2、in)、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白 5条区带。2.2.血清中不同蛋白质的等电点、分子量及含量血清蛋白质 等电点 分子量 占总蛋白的清蛋白 4.64 69,000 5772 1球蛋白 5.06 200,000 252球蛋白 5.06 300,000 49 球蛋白 5.12 90,000150,000 6.512球蛋白 6.857.3 156,000950,000 1220缓冲液 pH=8.6，pIpH。血清蛋白带负电荷，在电场中向正极移动。预测血清蛋白电泳区带图血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白的 1、2、 五个区带2.3.膜条经过氨基黑 10B染色后显出清晰色带；各色带蛋白质含量与
3、染料结合量基本成正比；可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。三、材料与方法：3.1.实验材料：3.1.1.实验试剂：样品：健康人血清（新鲜、无溶血）；巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度 0.06mol/L）；氨基黑 10B染色液；漂洗液；洗脱液：0.4mol/NaOH溶液。3.1.2.实验器材：V-1100 分光光度计（1）；恒温水浴箱（1）；试管（6）、试管架（1）；1000L 加样枪（1）、加样枪架（1）；醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度 120m）；培养皿（5）；点样器或载玻片（1）；平头镊子（2）；剪刀（1）；电泳槽（1）；直流稳压电泳仪（
4、1）3.2.实验步骤1准备与点样：取 28cm的膜条；亚光面距一端 1.5cm处取一点样线；充分浸透在巴比妥缓冲液中；取出膜条，用滤纸吸去多余的缓冲液；点样器下端粘上薄层血清；垂直点样。点样示意图：注意：点样线尽量点得细窄而均匀。样品标记2.电泳：放置膜条（点样面向下，点样端置于阴极）；膜条贴紧滤纸，拉直膜条；平衡五分钟；通电（调节电压 120v/电流，时间：4560 min）；关闭电源。电泳槽解剖图：3.染色、漂洗：通电完毕；取出膜条；浸于染色液（氨基黑 10B）中，5min；取出膜条，浸于漂洗液；反复漂洗 2次，直至漂净；滤纸吸干薄膜。8cmm2cm点样线点样区1.5cm(粗面）小组标记+
5、4.定量（洗脱比色法）（因实验室等原因，未做）四、结果与讨论：图一 染色后的膜条4.1.结果分析本次实验得到的图谱只能够清晰的看出清蛋白和 球蛋白的区带，其余无法区别。原因可能如下：醋酸纤维薄膜质量不足薄 膜 过 湿 ， 样 品 扩 散 迅 速 ， 导 致 样 品 分 离 不 成 区 带 。点样太少，区带显色不明显。电泳时间不足。薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足。取出电泳后的薄膜过程中曾不慎将薄膜掉到地上。染 色 时 ， 因 为 现 场 混 乱 ， 可 能 导 致 醋 酸 纤 维 薄 膜 不 是 一 张 一 张 放 入 染 色 液 的 ， 在染 色 固 定 前 ， 薄 膜 与 薄 膜 之 间 重
6、叠 ， 造 成 薄 膜 上 还 未 固 定 的 血 清 蛋 白 彼 此 粘 连 。4.2.课后思考题1.电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？答：点样端置于电场的负极。因为人体血清的蛋白质会因电槽中溶质呈碱性而带负电，要成功分离出各类各类蛋白质，理应将点样端置于电场的负极。2.电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在的原因。答：醋酸纤维薄膜质量不足；薄 膜 过 湿 ， 样 品 扩 散 迅 速 ， 导 致 样 品 分 离 不 成 区 带 ；点样太少，区带显色不明显；染色时，醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。电泳时电压，电流或电泳过小或时间不够，造成区带未分离。
