蛋白质定量的五种方法.docx

1、蛋白质定量的五种方法方法一 双缩脲法测定蛋白质浓度目的掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。原理双缩脲(NH 2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与 Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH 2NH2、-CS-NH 2等基团也有此反应。操作取中试管 7 支

2、，按下表操作。各管混匀、放置 37水浴中保温 20 分钟。用 540nm 比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。计算(一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。(二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(gL)，并求出人血清样本的蛋白质浓度。(三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(gL)。器材中试管 7 支，l 毫升刻度吸管 3 支，10 毫升刻度吸管 1 支，水浴箱，721型分光光度计、坐标纸。试剂()6N NaOH：称取 240g 氢氧化钠溶于 1000ml 水中。(二)双缩脲试剂：称取 CuS045H2O 3.0 克，酒

3、石酸钾 9.0 克和碘化钾5.0 克，分别溶解后混匀，加 6N NaOH l00ml，最后加水至 1000ml，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。如有暗红色沉淀出现，即不能使用。(三)0.9NaCl。(四)蛋白质标准液(10mgm1)，称取干燥的牛血清蛋白 100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入 l0ml 容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成l0mgm1 作为蛋白质标准液。(五)待测血清样本：将人血清或动物血清用生理盐水稀释 10 倍后再测定。方案二 Folin-酚试剂法(Lowry 法)测定蛋白质浓度目的掌握 Low

4、ry 法测定蛋白质浓度的原理。原理蛋白质在碱性溶液中其肽键与 Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。操作 取试管 7 支、编号、按下表操作：生理盐水生理盐水立即混匀，在 2025水浴保温 30 分钟。用 660nm 比色，测定光密度值。操作注意事项：1 按顺序添加试剂2 试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。计算 (一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲

5、线。 (二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(gL)。(三)再从标准管中选择管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(gL)。器材(一)721 型分光光度计(-)恒温水浴箱(三)中试管 7 支(四)刻度吸管：1. 0ml 二支；0.5ml 一支；5.0ml 一支。试剂(一)试剂甲(1)4碳酸钠(Na 2CO3)溶液(2)0.2N 氢氧化钠溶液(3)1硫酸铜溶液(CuSO 45H2O)(4)2酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按 50：1 比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。(一)试剂乙：

6、(1)市售酚试剂在使用前用 NaOH 滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为 1N。(2)或取 Na2WoO42H2O l00g 和 Na2MOO3 25g。溶于蒸馏水 700ml 中，再加85 H 3PO4 50ml 和 HCl(浓)100ml，将上物混合后，置 1000ml 圆底烧瓶中温和地回流十小时，再加硫酸锂(Li 2SO4H2O)150g，水 50ml 及溴水数滴。继续沸腾15 分钟后以除去剩余的溴，冷却后稀释至 1000ml 然后过滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用时用标准 NaOH 滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后酸

7、度为 1N。(三)标准蛋白质溶液用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成 0.25mgml 的蛋白质溶液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)。(四)待测样品：准确取血清 0.1ml，置于 50ml 容量瓶中，再加 0.9NaCl溶液至刻度，充分混匀，也可以用尿液为样品。方案三 紫外分光光度法测定蛋白质浓度目的：掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理，熟悉紫外分光光度计的使用。原理蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在 280nm 波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋

8、白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或且已经知道其消光系数作为参考。另外，不少杂质在280nm 波长下也有定吸收能力，可能发生干扰。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。然而核酸的最大吸收峰是在 260nm。因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定 OD260nm，与 OD280nm。，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化之蛋白质的微量测定。主要缺点：当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生定误差，混有核酸

9、时必须分别测定 280nm 和 260nm 两处的OD 值，再按公式推算蛋白质含量。操作取试管 7 支，按下表操作：0.43.6各管混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以空白管调节零点，分别于 280nm、260nm 波长下测定各管光密度，计算(一) 直接根据标准液与待测液的光密度值(OD 280nm)，或从标准曲线，求得样本蛋白质含量。以标准管各管光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线，然后根据测定管光密度值，直接查标准曲线求得样本中蛋白质的含量。1 选一种与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品，用生理盐水稀释至浓度为 lmgm1，作为稀释标准蛋白质溶液。2用生理盐水稀释

10、待测样本蛋白质至浓度约为 lmgm1，即为稀释样本蛋白质溶液。(二)利用经验公式直接计算样本蛋白质含量，准确吸取血清样本 0.1ml，置于 50ml 容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，即 500 倍稀释，在 280nm 和 260nm 两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。1、OD 2800D 2601.5 时，用 Lowry-Kalokar 公式：样本蛋白质含量(mgm1)1.45OD 280一 0.74OD2602、OD 280OD 2601.5 时，用 Lamber-Beer 定律计算：样本蛋白质含量(mgm1) = OD 280KL（OD 2806.31）10gL本实验样品：牛血清

11、白蛋白 E1%cm6.3（100mlcm.g）K：克分子消光系数；E 1%cm：百分比吸光度的吸光系数；注：不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异，故标准管与测定管的蛋白质氨基酸组成应相似，以减小误差。器材(一)UV-9200 紫外分光光度计(二)50ml 容量瓶试剂(一) 生理盐水(二) 清蛋白(人或牛)纯晶(三) 待测样本蛋白质：用双缩脲法测定蛋白质的样品用生理盐水稀释而成。方案四 考马斯（Comessie)亮兰结合法测定蛋白质浓度考马斯亮兰结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法。本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。【原理】考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感

12、性，考马斯亮兰 G-250 的最大光吸收峰在 465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为 595nm。考马斯亮兰 G250-蛋白质定量测定的高敏性度。在一定范围内，考马斯亮兰 G250-蛋白质复合物呈青色。在 595nm 下，光密度与蛋白质 含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。【操作】(常量法)(一)标准曲线制备：配制 lmgml 的标准蛋白溶液。制备系列稀释液，其浓度分别为1000gml，500gml， 250gml，125gml ，62.5gml 和31.25gml。按下表操作：摇匀，室温静置 3 分钟。在第一管为对照管，在 721 型分光光度计于波长595nm

13、处比色-读取光密度。以各管光密度为纵座标，各标准样品浓度(gml)作为横座标作图得标准曲线。(二)未知样品测定：取血清 0.25ml 直接置于 50ml 容量瓶中，加生理盐水至刻度，摇匀。(此法样品稀释 200 倍)。取试管二只，按下表操作：摇匀，静置 3 分钟，在 721 型分光光度计亡波长 595nm 比色，读取光密度，查标准曲线，求得稀释样品蛋白质浓度。【计算】未知样品蛋白质浓度 gml稀释样品浓度稀释倍数【优缺点】()操作简便、快速；检测灵敏；重复性好。(二)显色迅速。约于 2 分钟内完成染料与蛋白质的结合。所现颜色至少在l 小时内是稳定的。(三)与改良 Lowry 氏法相比，干扰物质

14、较少。(四)当样品中存在较大量的十二烷磺酸钠(SDS)、TritonX-100 等去垢剂时，显色反应会受到干扰。如样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色，故必须预先处理样品。(五)考马斯亮兰 G250 染液不宜久存，以 1-2 月为宜。(六)微量法测定蛋白含量范围为 1-10g；常量法测以检测范围 10-100g 为宜。【器材】(一)试管 l0 支(二)吸管 10ml、l5ml、lml、O.1ml 各 1 支。（三）721 分光光度法，普通比色杯 4 只。【试剂】(一)O.9NaCl(二)待测血清(三)标准血清(四)染液：考马斯亮兰 G250 0.1 克溶于 0.5 m1 95%乙醇。再加入 100

15、m1 85(WV)磷酸。然后加蒸馏水定容到 1000ml。此时溶液为 0.0l考马斯亮兰 G2504.7(WV)乙醇8.5%(WV)磷酸。方案五 BCA 法测定蛋白质浓度【目的】：掌握 BCA 法测定蛋白质浓度的原理。【原理】：BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将 Cu2+还原为 Cu+，一个 Cu+螯合二个 BCA 分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。【操作】标准曲线的绘制：取试管七支、编号【计算】（一） 绘

16、制标准曲线。（二） 以测定管吸光度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。（三） 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。【优缺点】(一) 操作简单，快速，45 分钟内完成测定，比经典的 Lowary 法快 4 倍且更加方便；(二) 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA 试剂的蛋白质测定范围是 20-200g/ml，微量 BCA 测定范围在 0.5-10g/ml。(三) 经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；(四) 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响。【器材】（一） 7220 型分光光度计（二） 恒温水浴

17、箱（三） 中试管 7 支（四） 枪式移液管【试剂】1、 试剂 A：1BCA 二钠盐 2无水碳酸钠 0.16%酒石酸钠 0.4氢氧化钠 0.95碳酸氢钠 混合调 PH 值至 11.25。2、 试剂 B：4硫酸铜。3、 BCA 工作液：试剂 A 100ml 试剂 B 2ml 混合。4、 蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml 的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定）5、 待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前 BCA 法的试剂盒市面有售。总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。