免疫分析法 PPT课件.pptx

1、第三章 免疫分析法,4.1 概述4.2 抗原或抗体的检测方法4.3 抗体的制备4.4 抗体纯化技术,主要内容:,3,一、抗体的概念与分类,定义一：抗原诱导由淋巴细胞合成和分泌的，具有特殊氨基酸序列和结构的免疫球蛋白分子(Ig)。 定义二：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,4.1 概述,4,免疫球蛋白基本类型,5,抗体的结构, 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.,人源的免疫球蛋白的物理化学属性,7,二、抗体的主要作用

2、,结合抗原中和毒素促进吞噬功能,8,结合抗原和中和毒素, 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.,9,促进吞噬功能,三、抗原与抗体反应的特点,1. 特异性 抗原与抗体相互结合只局限于一些大分子表面的特定部位，即抗原决定簇和抗体结合位点之间，且以亲和力的作用方式结合在一起。抗原抗体的结合并没有共价键形成，而是由这些特定部位之间的短程分子力相互作用的结果。这些吸引力只有在极短的距离内才有效。因此抗原决定簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧

3、密接触状态，才能产生足够的结合力。这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。,2. 抗原与抗体结合的可逆性 抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应Ab+Ag Ab:Ag 由于抗原抗体结合的可逆性，可利用亲和层析法分离纯化抗原或抗体；利用待测抗原和标准抗原与抗体的竞争结合，进行抗原或抗体的定量测定，如放免检测法、酶联免疫吸附法等,3、抗原与抗体反应中量的关系 当抗体与抗原结合时，如果是颗粒抗原，则出现凝集现象；如果是可溶性抗原，则产生沉淀作用。这些可见现象的出现是以抗原与抗体反应特异性和亲和力为基础的，同时也是抗原抗体反应的继发过程。 当抗原与同型抗体相遇时，在合适条件下，不论彼此量的多少，都

4、立即发生特异性的结合形成抗原抗体复合物，这一过程通常只需要几秒的时间便可完成，称为反应的一级阶段。,在一级阶段之后，继发出现抗原与抗体间进一步交联而形成网络状凝集物，进而出现可见的凝集和沉淀，称为反应的二级阶段。这一阶段是抗原抗体网格生长的阶段，速率要慢的多，且在很大程度上依赖于温度、离子强度等外界条件，但更重要的是需要合适的抗原抗体分子比例。只有当二者的结合价彼此饱和时，才能连接成一个大网格样凝集物，出现凝集或沉淀。,在一定量抗体存在下抗原与抗体反应的数量关系及机理,（一）电解质 抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原-抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可

5、见反应，故免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体。 （二）酸碱度 抗原抗体反应的最适pH是68。超出此范围可影响抗原、抗体的理化性状，出现假阳性或假阴性。,四、抗原-抗体反应的影响因素,（三）温度 适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会，加快二者结合速度。抗体-抗原反应的最适温度为37。某些抗原-抗体反应有其独特的最适温度，如冷凝集素在4左右与红细胞结合最好，20以上反而解离。此外，适当震荡或搅拌也可促进抗原-抗体分子的接触，提高结合速度。,（四）抗原和抗体的性质 抗体的特异性和亲和力是决定抗原-抗体反应的关键因素。从免疫早期动物所获抗血清其亲和力一般较低，而后期所得抗血清一般亲和力较高；单

6、克隆抗体亲和力较低，一般不适用于低灵敏度的沉淀反应和凝集反应。此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原-抗体反应。 抗原和抗体的浓度、比例对抗原-抗体反应的影响最大，是决定性因素。,3.2 抗原或抗体的检测方法,一、免疫沉淀反应,可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。,1. 液相沉淀反应,2. 凝胶扩散沉淀,3. 凝胶免疫电泳,絮状沉淀,环状沉淀,免疫浊度沉淀,单向琼脂扩散试验,双向琼脂扩散试验,血清免疫电泳,火箭电泳,对流免疫电泳,免疫印迹等,（1） 絮状沉淀试验,操作步骤：（a） 将可溶性抗原作一系列

7、倍比稀释。（b） 各管加入一定浓度的适量抗血清。（c） 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37孵育。（d） 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。,1. 液相沉淀反应,(2) 环状沉淀试验,操作步骤：（1）用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（550mm）底部，避免产生气泡。（已知！）（2）将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（待测！ ）（3）置沉淀管于室温下使其反应，15min内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。 应用：主要用于抗原的定性试验。

8、用已知抗体来检测未知抗原。（细菌分型、血迹鉴定）。,在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成免疫复合物，液体混浊。用浊度计测量反应体系的浊度，可绘制标准曲线并依据浊度推算样品中抗原含量。该法快速简便，近年来发展很快，已建立数种不同类型的测定方法，如透射比浊法、散射比浊法、免疫胶乳比浊法以及速率抑制免疫比浊法等。,(3)免疫比浊,2. 凝胶扩散沉淀,凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部位相遇形成沉淀线的反应。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。最常用的方法为： 单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验,将一定量已知抗体混于琼

9、脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔并加入抗原)。,抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量呈正相关。取已知量抗原绘制标准曲线，可根据所形成沉淀环的直径，从标准曲线中查出待检标本的抗原含量。,(1) 单向琼脂扩散试验,(2) 双向免疫扩散 将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。若反应体系中含两种以上抗原-抗体系统，则小孔间可出现两条以上沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原的相关性分析。,双向免疫扩散的应用,(1) 抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计 (2) 抗原或抗体相对分子量的估计,（3）抗

10、原性质的分析,(4) 抗体效价的滴定(5) 抗原或抗体纯度的鉴定,3. 免疫电泳技术,免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。免疫电泳包括：血清免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、免疫印迹等。,（1） 火箭免疫电泳,单向免疫扩散电泳，定量检测技术,原理：双向扩散+ 电泳比双向扩散试验灵敏度提高816倍,（2）对流免疫电泳,（3）血清免疫电泳,将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示病人血清

11、与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加。,原理：区带电泳 + 双向扩散,二、凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，此为凝集反应(agglutination)。,1. 直接凝集 细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象。其方法为：已知抗体与相应抗原在玻片上反应，用于抗原的定性检测（如ABO血型鉴定、细菌鉴定）；在试管中连续稀释待检血清，加入已知颗粒性抗原，用于抗体的定量检测（如诊断伤寒病的肥达试验）。,2. 间接凝集 将可溶性抗原包被在与免疫无关的载体颗粒表面，再与相应抗体反应，出现颗粒物凝集现象。常用载体为人O型血红

12、细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒等。,3. 间接凝集抑制试验 其原理是：将待测抗原（或抗体）与特异性抗体（或抗原）先行混合并作用一定时间，再加入相应致敏载体悬液；若待测抗原与抗体对应，即发生中和，随后加入的相应致敏载体颗粒不再被凝集，使本应出现的凝集现象被抑制，故得名。此试验可用于检测抗原或抗体（如早孕的检测），其灵敏度高于一般间接凝集试验。,在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行的抗原抗体反应。实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），底物为二苯基联苯胺。,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）,ELISA试验三个必要的试剂：,(1) 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）(2) 酶标记的抗原或抗体（标记物）

13、(3) 酶作用的底物（显色剂）,底物显色定性或定量的分析,原理,包被,反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体,洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离,1,2,3,4,基本步骤,常见的检测方法,1、双抗夹心法（测定抗原）2、测定抗体的间接法3、竞争法测定抗原,适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及低于二价的小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心,1. 双抗夹心法测抗原,2. 间接法测抗体,（1）将Ab吸附在固相载体表面; （2）加入酶标Ag和待测Ag，竞争结合Ab； 对照只加入酶标 Ag； （3）加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知Ag量。,3. 竞争法测定抗

14、原,4.3 抗体的制备,一、多克隆抗体制备,制备免疫原,免疫动物,取血,纯化抗体,鉴定抗体,（一）免疫原的制备免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）。免疫原天然抗原、人工或合成抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；具体制备：细胞性抗原、可溶性抗原、半抗原性抗原和免疫佐剂。,1、细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）2、可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。,免疫学活性鉴定：免疫双扩散、免疫印迹,3、半抗原性免疫原的制备 半抗原（hapten）：小分

15、子 蛋白质等载体（carrier）：BSA、OVA 连接物理法：即利用电荷和微孔吸附 半抗原 化学法：利用某些功能基团把半抗原连接到载体分子上,4、免疫佐剂（immunoadjuvant）佐剂指某些物质，因为该类物质与抗原物质一起或先于注入机体，可增强机体对该抗原物质的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。种类无机、生物性、人工合成、油剂和纳米颗粒。用途抗原表面积增，构型改变；延长抗原的滞留时间；增强吞噬。,（二）免疫动物,1、免疫动物的选择： 抗原来源与动物种属的关系（越近越差） 动物个体的选择（年龄、体重与健康） 抗原性质与动物种类2、免疫的方法： 免疫原的剂量：1.0-10 mg/kg体重

16、免疫的途径与其间隔时间：多点、少量肌肉或皮下注射，2-6周 免疫动物采血：静脉采血、动脉采血,(三)免疫血清的鉴定,1、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA）2、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散）3、纯度的鉴定（SDS-PEAG）4、亲和力的鉴定affnity指抗体与抗原结合的牢固程度，以亲和常数表示。测定方法有平衡透析、ELISA、竞争（非竞争）结合等。,（四）免疫血清的保存,1、4保存（6个月） 2、低温保存（-70 -20 ，5年） 3、真空干燥保存（5 10年） 注意点：保存前需经除菌；保存液含防腐剂；避免反复冻 融（分装）。,表位A,表位B,表位C,抗原,克隆A,克隆B,克隆C,二、

17、单克隆抗体的制备,55,杂交细胞：在诱导物的作用下同一细胞或不同细胞间的融合，融合的细胞具有双亲本细胞的染色体和全部或部分特性。杂交瘤细胞：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后产生的杂交细胞。单克隆抗体：具有分泌抗体能力的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞经无性繁殖形成的细胞系分泌产生的活性、亲和力均相同的抗体。,杂交瘤技术的原理,随机融合后的细胞类型,细胞组合 HGPRT 生长状态脾细胞 + 骨髓瘤 + 长期生长脾细胞 + 脾细胞 + 短期生长骨髓瘤 + 骨髓瘤 - 不能生长未融合脾细胞 + 短期生长未融合骨髓瘤 - 不能生长,HAT选择培养原理,核苷酸从头合成途径（de novo synt

18、hesis）,核苷酸补救合成途径（salvage synthesis）,核苷酸,DNA,氨基碟呤（A）,次黄嘌呤（H）,胸腺嘧啶核苷（T）,单克隆抗体的制备过程,1. 用特定的抗原免疫动物,2. 从脾中取出B淋巴细胞,2. 骨髓瘤细胞,3. 获得杂交瘤细胞,4. 培养并筛选能产生抗体的单个杂交瘤细胞,5. 优化培养目的杂交瘤细胞,6. 纯化单克隆抗体,60,制备抗原凡具有抗原性的物质均可免疫时抗原纯度可不高纯度高的抗原利于以后筛选,骨髓瘤细胞常用的骨髓瘤细胞系小鼠的BALB/c细胞系大鼠的Lou细胞系免疫动物应与骨髓瘤细胞供体相一致,61,一般选40-50%的PEG 进行诱导。细胞融合后培养液

19、中有脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤、脾、瘤等细胞。常用的选择性培养基为HAT培养基。,62,将经融合的混合细胞用HAT培养液悬浮稀释。一般在含有饲养细胞的96孔板中进行。在融合后7d用HAT选择培养基培养，7-14d用HT培养基培养，14d后用完全培养基培养。,63,选择培养后，只有杂交瘤细胞才能生存。但不是所有的杂交瘤细胞均能产生所需的抗体。产生特定抗原的抗体的B细胞只占所有脾细胞的5左右。用抗原对所有小孔的培养上清进行抗体检测，筛出能产生目的抗体的杂交瘤细胞。,64,将能产生目的抗体的培养小孔中的杂交瘤细胞进行稀释。可用有限稀释法。有限稀释时，将细胞稀释液分加到96孔板中，使每个小孔在理论上只有一

20、个细胞。,65,培养后，取上清进行抗体检测，获得能产生目的抗体的杂交瘤细胞系。大量生产目的单克隆抗体。 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，10 g/ml。 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清， 5-20 mg/ml。,单克隆抗体的鉴定,1. 抗体特异性的鉴定：免疫印迹、双向免疫扩散等2. McAb的Ig类与亚类的鉴定：双向免疫扩散法或夹心ELISA3. McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。4. McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。,多抗与单抗的比较,多抗 单抗 单抗 （血清） （腹水） （培养上

21、清）特异性抗体含量（mg/ml） 0.1-1 0.5-5 0.005-0.025无关Ig含量（mg/ml） 10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 极少 均一性 + +特异性 多决定簇 单决定簇 单决定簇稳定性 较好 略差 略差重复性 差 好 好,68,单克隆抗体的特点,单抗中抗体分子在氨基酸序列和空间构型上均相同。单抗具有高度的特异性。产生单抗的细胞系可长期传代并保存，可持续生产同一性质的抗体。,69,单克隆抗体的不足,目前单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（human antimouse antibody, HAMA)人体的排斥反应人体内半衰期只有5-6小时到达靶组织的药

22、量仅有1完整的抗体分子的相对分子量较大，穿透力不强，难以到达病灶的核心部位,基因工程抗体(重组抗体)：是指应用DNA重组及蛋白，工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。,三、基因工程抗体,71,目标,降低免疫原性。降低相对分子量，增加穿透力。,技术手段,用DNA重组和蛋白工程技术对已有的单抗进行改造。 包括人源化抗体、小分子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等的制备。 用抗体库技术筛选、克隆新的单抗。,（一）人源化抗体（humanized antibody）,人源化抗体指将鼠源性单抗，通过基因克隆和DNA重组及蛋白质工程学等技术，用人源氨基酸序

23、列取代鼠的使其保留亲本鼠单抗的亲和性与特异性，但降低鼠单抗的异源性利于人体内使用。1、嵌合抗体（chimeric antibody）2、改形抗体（reshaped antibody）,嵌合抗体,方法： 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。特点： 减少了鼠源性抗体的免疫原性，保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力,嵌合抗体,人鼠嵌合抗体不足：,虽然人鼠嵌合抗体与鼠源性抗体相比，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应，但仍不能完全消除。,75,改形抗体又叫CDR移植抗体，抗体可变区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特

24、异性。改形抗体是将鼠单抗的CDR移植到人Ig分子的骨架区中，换下其CDR序列而形成的抗体。,改形抗体(reshaped antibody),二、小分子抗体,小分子抗体指相对分子质量比较小但具有抗原结合功能的分子片段。小分子抗体：抗原结合片段（Fab）、可变区片段（Fv）等。,77,小分子抗体的优点,分子质量小，免疫原性低。易于进入实体瘤周围的微循环甚至进入实体瘤的内部。无Fc片段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，用于免疫诊断时成像清晰。构建较简单，易于操作和改造。可在细菌中表达，易于大量生产。可与多种效应分子如毒素、前体药物转化酶等构建多种双功能抗体分子。,78,小分子抗体的缺点,多为单价抗

25、体，与抗原结合活性相对较弱。半衰期短，能很快从血液中清除，从而可能影响治疗的有效浓度。,3.4 抗体纯化技术,抗体纯化的目的,去除：杂抗体（交叉反应抗体）杂蛋白（提纯IgG及其片段）,抗体或者抗体片段通常是从天然或重组体系中提取的，抗体来源的选择会影响到样品处理和纯化的步骤，因为不同来源的杂质和需要的目标分子纯度是不同的。,一、样品处理,抗体主要污染物来源,抗体主要污染物来源,目标抗体的来源和位置情况决定了提取的步骤，细菌或者哺乳来源，胞内或者胞外表达系统，蛋白可溶还是包含体，这些都需要了解。使用尽可能温和的提取手段，避免蛋白水解。仅在必须稳定蛋白或者增强提取效果时才使用添加剂。选择容易被除去

26、的添加剂，否则会增加纯化的步骤。当需要溶解蛋白时，可以选择加入8M尿素或者6M盐酸胍，例如在纯化包涵体时。,重组抗体以及片段的提取,沉淀法：硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀等离子交换色谱亲和色谱Protein A色谱Protein G色谱嗜硫色谱,二、常用的抗体纯化技术,聚乙二醇沉淀纯化IGY实例,1份蛋黄+2份PBS+PEG 6000，3.5%（W/V），室温孵育20 min，14000 g 10 min,取上清过滤，去除蛋黄中的脂肪,滤液加PEG 6000至终溶度为12%（W/V），室温孵育20 min，14000 g 10 min,取沉淀，加入PBS溶解，终体积与原蛋黄液体积相同，加PEG 60

27、00至终溶度为12%（W/V），室温孵育20 min，14000 g 10 min,取沉淀，加PBS溶解，透析,1：蛋白质分子质量标准;2：标准IgY；3：最终沉淀得到的IgY。,Protein A色谱,A蛋白是来自SA菌株的蛋白，它包含可以结合IgG上Fc区域的五个结构域，作为亲和配体，A蛋白通常被偶联到Sepharose上，并可暴露出这些结构域，用来结合IgG。一分子偶联的A蛋白最少可以结合两分子的IgG。,缓冲液处理结合缓冲液：20mM磷酸钠，pH7.0洗脱缓冲液：0.1M 柠檬酸缓冲液，pH3.0中性缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.0,纯化步骤：1. 在收集管中加入60-200

28、ul 1M Tris-HCl，pH9.0（每管收集1ml样品），这可保证最终样品的pH趋近中性。2. 如果柱子中含有20乙醇，用5倍柱体积的蒸馏水冲洗，线性流速为50-100cm/h。3. 使用5-10倍柱体积的结合缓冲液，以150cm/h的速度平衡柱子。4. 加入处理好的样品。5. 用结合缓冲液冲洗，直到吸收值达到基线。6. 使用洗脱缓冲液，以逐步或线性梯度洗脱。7. 洗脱后使用5-10倍柱体积的结合缓冲液再生柱子，柱子可以用于一轮新的纯化。,Protein A 纯化实例,1：蛋白质分子质量标准；2：亲和穿透峰；3：亲和洗脱峰,纯化目标：腹水中乙肝核心抗原单克隆抗体前处理：离心、过滤和缓冲溶

29、液变换预处理,G蛋白是一种来自Group G streptococci 的细胞表面蛋白，它属于第三类的Fc受体蛋白。同A蛋白一样，G蛋白能够同IgG上的Fc区域特异性的结合，但是对某些多克隆的IgG和人源的IgG3的结合更加紧密。在通常的缓冲液体系下，G蛋白能够同所有的人源和鼠源的IgG结合，包括鼠源IgG1。G蛋白也能够结合A蛋白所不能结合或者结合很弱的IgG2a、IgG2b,Protein G色谱,G蛋白能够比A蛋白对IgG的具有更强的结合能力，而且对白蛋白的结合性更弱，这能提高产品的品质和产量。,缓冲液处理结合缓冲液：20mM磷酸钠，pH7.0洗脱缓冲液：0.1M 甘氨酸-盐酸缓冲液，pH2.7中性缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.0,