1、睡眠剥夺对小鼠免疫能力的影响,组员：杜晨阳、辛凯悦、 李毅、朱灵凤、舒文静,主讲人：辛凯悦指导老师：朱艳媚,研究对象,免疫功能测定,研究目的,讨论,统计,正文参考文献,实验预期,动物模型的建立,睡眠剥夺对小鼠免疫能力的影响,睡眠是一种生理现象，睡眠充足与否与人体健康有着密切联系。长期睡眠剥夺可引起人或动物产生不良情绪反应、免疫功能下降等等。随着生活节奏的加快，越来越多的儿童与成年面临睡眠不足的危害，这已足够引起人们的注意。本小组通过一种慢性不完全剥夺小鼠睡眠实验来观察睡眠不足对小鼠免疫功能的影响。,研究目的,实验对象,一组：健康雄性小鼠20只，体重222g,随机分成a组、b组，即正常对照组和慢
2、性不完全睡眠剥夺组。二组：健康雄性小鼠20只，体重222g,随机分成c组、d组，即正常对照组和慢性不完全睡眠剥夺组。三组：健康雄性小鼠20只，体重222g,随机分成e组、f组，即正常对照组和慢性不完全睡眠剥夺组。,动物模型的建立,采用轻触法一、二组对小鼠不完全剥夺睡眠，每天剥夺睡眠时间从上午六点到下午五点结束。其中a组、c组是实验组，b组、d组是对照组。具体方法为：当实验组小鼠出现睡眠状姿势时，即用毛笔轻触小鼠使其保持清醒状态，当小鼠处于清醒状态时则不对其进行任何刺激，在睡眠剥夺过程中，正常对照组始终可以自由睡眠。一个周睡眠剥夺后，进行免疫功能的测定。,免疫功能的测定,器材：滤纸，粗剪刀，婴儿
3、称对象：第一组实验小鼠,胸腺指数和脾脏指数的测定,1.,实验准备,实验步骤,实验步骤：（1）用颈椎脱臼法处死第一组小鼠并立即称取体液（2）解剖摘取小鼠的胸腺和脾脏，用滤纸吸干残血后，称重（mg）（3）所得重量分别除以小鼠体重(g)，再乘以100，即分别得到胸腺指数和脾脏指数。胸腺指数=（胸腺重量/小鼠体重）10脾脏指数=（脾脏重量/小鼠体重）10,2.外周血T淋巴细胞亚群检测,（1）两组小鼠分别自眼底静脉丛取血，肝素抗凝。吸取抗凝全血100L，加入预先调制好的FITC-CD3PE-CD4PE-Cy5-CD8 3种荧光标记抗体混合液12L，并设置荧光同型对照。室温避光反应20min,然后加入红细
4、胞溶解液，每份标本加1ml，混匀，室温避光10min,见细胞悬液呈亮红色时，说明红细胞被裂解，再加入含20mL/LFCS的生理盐水，以400g离心洗涤细胞2次，洗涤后的细胞最终回复到500L（2）将两组液体移入流式专用管，上流式细胞仪检测,3.红血球凝集实验,红血球凝集指红细胞凝集的现象。由病毒、细胞凝集素和抗体而引起的红细胞凝集。在病毒而引起的凝集中，如果存在抗病毒的抗体时，则由病毒引起的凝集作用将被抑制，所以可用于抗病毒抗体的检出。,实验准备,器材：96孔“U”形或“V”形微量反应板，50 uL定量移液器，滴头，微型振荡器。药品：特定病毒抗原，0.5%小鼠红细胞对象：第二组实验小鼠,用特定
5、病毒抗原对两组小鼠进行免疫，一定的时间后抽取小鼠血液制成血清滴在反应板上，用特定病毒进行滴加，观察血液凝剂情况并记录,对已经免疫的A组小鼠进行不同程度的睡眠剥夺，B组不做睡眠剥夺，然后对实验小鼠进行上述血凝操作，观察血凝情况,对照组,实验组,实验步骤,96孔微量反应板的清洗,将浸泡有75%乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37温箱中干燥。,0.5%红细胞制备方法,先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1/5)，从小鼠静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10mi
6、n，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5%小鼠红细胞悬液。,统计学方法,所有数据均用均数 标准差表示，各组均数间的差异显著性用t检验判断。P0.05表示差异不具有显著性。,参考文献,1洪军,马文龙.睡眠剥夺的对策J.第一军医大学学报,2001,21(2):1521542何志恒,印大中.睡眠研究的科学前沿J.生命科学研究,2002,6(4):1841873李洋,谢扬丽,胡志安.感染和免疫反应对睡眠的影响J.生理科学进展,2007,38(2):1871904赵忠新.临床睡眠障碍学M.上海：第二军医大学出版社,2003:25
7、455丁琳,胡晓波.睡眠剥夺对机体的影响期刊论文.微量元素与健康研究,2010(6),睡眠剥夺是指由于某种原因导致的睡眠数量被迫减少，它对机体的影响是十分明显的。它可以造成机体疲劳、作业能力降低、免疫力下降、警觉水平降低，并引起情绪改变、精神不振、粗心、注意力不集中、食欲下降、记忆力下降、工作效率低等不良反应。不完全睡眠剥夺可导致免疫功能的下降. 机体内过量的自由基可对机体产生伤害,其重要原因是产生脂质过氧化物,造成对细胞结构和功能的破坏,从而导致衰老和各种疾病,机体内超氧化物歧化酶(SOD) 的功能是清除体内的氧自由基,从而对机体起到保护作用 ,增强免疫力. 有研究表明,长期睡眠较差的人的血
8、清过氧化脂质明显偏高,红细胞SOD 活性明显偏低,从而导致机体免疫力下降.。本实验的预期结果是慢性不完全睡眠剥夺会对小鼠的免疫器官产生伤害,其机制可能与上述因素有关。,实验预期,1.胸腺指数和脾脏指数的测定 经过一段时间的慢性不完全睡眠剥夺会对机体免疫功能产生伤害，胸腺和脾脏均会受到损害，表现为胸腺指数和脾脏指数分别下降。2. 外周血T淋巴细胞亚群检测 睡眠剥夺以后的小鼠体内的T细胞总数将减少。实验组CD4 +T小宝数量没有明显变化，而CD8 +T细胞数量均有下降，即杀伤性T细胞数量减少，导致CD4/CD8明显增大。,3.红血球凝集实验 在反应板上可以直观地观察到：对照组红细胞不凝集，在反应板的微孔中红细胞沉底呈点状，经过免疫的小鼠体内产生较多的抗体，可以与加入的流感病毒反应而抑制鸡血红细胞的凝集作用；实验组的红细胞凝集，在反应板的微孔中平铺呈网状，即经过睡眠剥夺的小鼠免疫能力会下降，产生的流感病毒抗体减少，流感病毒与鸡血红细胞产生凝集作用要强于对照组。,谢 谢 ！,The End,
