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肺炎链球菌检测.ppt

1、肺炎链球菌检测,培养、鉴定、分型,简介,肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)简称肺炎球菌(pneumococcus)。1881年首次由巴斯德(Louis Pasteur)及G. M. Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出。为革兰染色阳性,菌体似矛头状,成双或成短链状排列的双球菌,有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。5%10%正常人上呼吸道中携带此菌。有毒株是引起人类疾病的重要病原菌。,标本中SP形态,形态:矛头状 排列:成双排列 特殊结构:可有荚膜,分布,在自然界中分布广泛,常生活在正常人的鼻咽部,多数不致病或致病力很弱,少数致病力较强。在免疫力

2、下降时致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿,年老体弱者易导致肺部感染。无论从哪种标本中分离出肺炎链球菌,均应及时报告。,国外感染情况,在美国,每年侵袭性SP感染的发生率为72-103/10万儿童,而欧洲为10-24/10万儿童/年。每年约有600多万例中耳炎由SP引起,占急性中耳炎30-50;在发展中国家,每年约有500万5岁以下儿童死于SP引起的肺炎,10-50万儿童死于SP引起的脑膜炎。(2005年),国内情况,国内最早儿童肺炎链球菌脑膜炎个案报告在1942年。60年代中期以前研究资料显示SP肺炎、脑膜炎在冬春季发病较多,儿科住院病人中常见病例多发生在婴幼儿。SP性脑膜炎占化脑的11.1-

3、22.1,仅次于流脑。SP也是小儿肺炎的重要病原菌之一,SP所致大叶性肺炎,5岁以下儿童中可占70,国内情况,80年代后的研究资料显示SP脑膜炎占同期化脑的79.8。SP引起的败血症还是少见,约占5左右。一项13岁以下儿童中耳炎病原学研究显示SP引起的感染占病例31.7,是最常见的病原菌。,广东地区情况,我院2006年参与惠氏中国住院儿童肺炎流行病学调查研究,从入选的1097例肺炎住院儿童的痰标本中检出肺炎链球菌79例,检出率为7.2%。(中国抗感染化疗杂志)我院2005年-2007年检出313株SP,10株来自血液培养(10/513),脑脊液25株(25/113),中耳炎患儿的炎症分泌物检出

4、26株SP(26/133),来自呼吸道感染患儿的痰或咽拭子标本的SP有252株(252/1412)。(广东医学),广东地区情况,我院2005-2009年从化脓性脑膜炎患者脑脊液中共检出81株SP(24.18%,81/335)。(临床儿科杂志)我院2011-2012年从中耳炎患者耳分泌物中检出270株SP(36.78%,270/734)。我院2012年从五官科腺样体手术病人的腺样体或扁桃体组织中检出SP104株(40.78%,104/255)。,致病性,在化脓性球菌中,肺炎链球菌的致病力仅次于金黄色葡萄球菌。 肺炎球菌主要的致病物质 有荚膜,肺炎链球菌溶素O,脂磷壁酸和神经氨酸酶等。荚膜具有抗原

5、性,是肺炎链球菌分型的依据。所致疾病 主要引起大叶性肺炎,成人中75%由1,2,3,4,5,7,8,9,12型引起,半数以上为1,2,3型。3型产生大量荚膜物质,毒力强,病死率高。儿童以第6,14,19及23型肺炎链球菌感染最常见.可继发胸膜炎,脓胸,中耳炎,脑膜炎和败血症等。,肺炎链球菌感染的临床症状,在儿童起病多急骤(少数患儿先有轻微的上呼吸道感染症状),中毒症状重。突然高热、体温可达4041,头痛、胸痛、呼吸急促,烦躁不安,早期往往不咳嗽或轻咳,病儿常不吐痰。年长儿可有寒战、咯吐铁锈色痰,但有的患儿仍咳黄脓痰。重症患儿可有惊厥、谵妄及昏迷等中毒性脑病的表现 。,实验室常规检测,标本来源

6、痰、咽拭子、中耳分泌物、血液、脑脊液等。分离培养 血琼脂培养基。初次分离最好提供5%-10%CO2。常规鉴定 Option敏感试验、菊糖发酵试验、胆汁溶菌试验等。,SP培养呼吸道标本的采集,1.抗菌药物使用前取材;2.最好清晨采取痰标本;3.疑似细菌性肺炎患者痰标本每天一次,连续2-3天,不建议24h内多次送检,除非痰液外观性状发生明显改变;4.自然咳痰法取样可用于成人,先应刷牙、清水漱口,量不少于1mL;,SP培养呼吸道标本的采集,5.儿童以支气管镜抽吸为佳,肺泡灌洗液也不错,或者用弯压舌板压舌,棉拭子伸入咽部取样(临床医生操作);6.其他的经人工气道吸引分泌物、穿刺取样、胃内取样均可以取得

7、合格标本(临床医生操作)。,SP培养呼吸道标本的运输和保存,尽快送检,要求2h内送到;肺炎链球菌延迟送检极有可能死亡,而且不适合4保存;标本处理前检测是否合格。 痰标本合格的标准: 痰标本鳞状上皮细胞 白血球 细菌种类 合格 =10 1-3种 不合格 =25/低倍 3种,培养特性,初次分离需要CO2,采用CO2培养箱较好;18-24h形成细小、圆形、湿润、自溶的菌落,有草绿色溶血环。有少数菌株呈黏液型或颗粒状。最好选用新鲜绵羊血的BAP,有效期应该注意,不像标示的有效期那么长。加庆大霉素的血琼脂平板:在普通血琼脂中加入抑制剂庆大霉素注射液,混匀倾倒平板,琼脂中庆大霉素最后浓度相当于1.25 m

8、g/250mL。,粘液性菌落,SP常见菌落,鉴定,Optochin(乙基羟化奎宁,奥普托新)敏感(生长抑制)试验:在涂布细菌的血琼脂平板上贴5g的Optochin纸片,35有氧环境下过夜,出现14mm的抑菌环为敏感,草绿色链球菌仅小抑菌环或无抑菌环,肺炎链球菌有少数菌株不敏感。 对疑似OP不敏感的肺炎链球菌可用胆汁溶菌试验鉴定。,OP敏感,鉴定,胆盐溶菌试验:滴加胆汁酸盐在血平板上生长的菌落上,置3710-30min,可以看到滴加试剂的部位菌落溶化。 试管法:在0.9mL隔夜培养液中加入0.1mL去氧胆酸钠溶液,37水浴1030分钟,培养液由浊变清为阳性。用生理盐水代替去氧胆酸钠溶液作阴性对照

9、。能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、菊糖等多种糖类,不分解甘露醇、山梨醇。,鉴定,有明显的菌落特征:中心凹陷(自溶)。不典型菌落与其他非溶血链球菌鉴别肺炎链球菌:OP敏感、胆汁溶菌阳性、胆汁七叶苷阴性;草绿色链球菌:三个试验均阴性;牛链球菌:OP和胆汁溶菌阴性,胆汁七叶苷阳性。,SP菌种保存,保存液配制 TSB 3g,甘油25mL,蒸馏水100mL,灭菌后加入无菌马血清100mL,分装在无菌干燥管。保存 挑选新鲜培养物置于保存管中,-76保存。复活 取出保存管自然平衡至室温,接种适合平板。,SP血清学分型:,肺炎链球菌的血清分型可以为肺炎链球菌疫苗研究提供可靠依据,也是一种流行病学调查手段。肺炎链球

10、菌的抗原成分较多,有菌体核蛋白、菌体种属特异性抗原、荚膜多糖抗原等。,SP血清学分型,荚膜多糖抗原:亦称型特异性抗原,存在于肺炎链球菌的荚膜中,由大量多聚体组成,能溶于水,有型特异性,故称之为可溶性特异性物质(SSS)。不同菌株所含荚膜多糖不同,故可用凝集、沉淀和荚膜肿胀试验,进行肺炎链球菌分型。目前至少可将有荚膜的肺炎链球菌分成83个血清型。,血清分型,丹麦Statens Serum Copenhagen公司产pneumotest-kit 23价标准血清分型试剂盒;原理:荚膜肿胀试验;观察:相差显微镜观察最好,可以看到菌体周围有一无色宽厚的环状荚膜。,血清分型,我们的做法:以亚甲蓝染色,普通

11、显微镜可以观察,菌体蓝色,周围有一圈着色较浅的宽的荚膜。,血清分型:,1 细菌复苏:将肺炎链球菌冻存管从-76冰箱取出,挑取3-5L菌液接种于普通羊血培养基,35、5%CO2培养18-24小时,挑取单个菌落做次代培养。2 配制PBS溶液,并分装小试管,每管约0.5mL,用亚甲蓝粉配制0.1的亚甲蓝试剂。,SP血清学分型步骤:,3 用接种环挑取经次代培养后的肺炎链球菌菌落,放入小试管中,制成菌悬液约0.5麦氏单位浓度。4 用接种环挑取约10L菌悬液放入载玻片上,再挑取同量的诊断血清(10l)放入载玻片上,并与菌悬液搅拌混匀。,SP血清学分型步骤:,5 再加入一接种环0.1的亚甲蓝溶液放入载玻片上

12、与抗血清混匀一分钟,盖上盖玻片,在显微镜下观察是否有荚膜或凝集出现。6 出现凝集或荚膜肿胀的抗血清型即为该肺炎链球菌的血清型。,常见的血清型:,常引起人类疾病的血清型20多种,最常见的血清型有:6B、9V、14、19A、19F、23F。国内儿童流行的主要是:6A、6B、23F、19F、14、4、不定型。,国内儿童的血清型流行情况:,7价疫苗和13价疫苗比较,7价疫苗: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F。13价疫苗: 以上7价加上1, 3, 5, 6A, 7F, 19A。,疫苗涵盖(100),肺炎链球菌血清型流行趋势,肺炎链球菌的血清型分布随国家和年龄组的变化不大,欧洲国

13、家和美国有着相似的血清型分布,美国的常见血清型依次为6B、19F、23F、14、18C,荷兰常见的血清型分布依次为19F 、6B、6A、9V、23F。亚洲的情况略有不同,韩国以15、14、6B、19F较普遍,而印度以6、14、19、15型较多见。(2006年),SP的药物敏感性,除万古霉素外,对其他药物均有耐药性菌株出现;对青霉素的耐药不是-内酰胺酶引起,不能用-内酰胺酶试验来预测青霉素的敏感性;青霉素的敏感性可以用1g的苯唑西林(OX)纸片检测,抑菌环20mm,表示对青霉素敏感,对头孢曲松和头孢噻肟也敏感;,肺炎链球菌的药物敏感性,OX抑菌环20mm时应该检测青霉素的MIC;筛选青霉素的耐药

14、性只用1gOX,不能以甲氧西林或青霉素纸片代替,防止假敏感性出现;药敏试验的培养基:加5%脱纤维羊血的MH平板。,敏感性预测,青霉素MIC 能预报对其他-内酰胺类敏感性: 青霉素MIC0.06g/ml(或苯唑西林的抑菌环20mm)提示分离株对氨苄西林(口服或注射)、氨苄西林/舒巴坦、头孢克罗、头孢地尼、头孢托仑、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢唑肟、头孢呋辛、亚胺培南、氯碳头孢和美洛培南等敏感。 青霉素MIC2g/ml 提示对阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松和厄他培南等敏感。,本地耐药情况趋势:,广东地区儿童PRSP低于匈牙利、韩国、台湾,与香港接近,高于上海、北京,表明广州

15、地区儿童鼻咽部肺炎链球菌对青霉素的耐药情况较为严重,且有上升趋势,可能与滥用抗生素,使细菌产生诱导性耐药有关,也可能由于青霉素不敏感克隆株在国内的传播和蔓延。,本地区耐药情况,大环内脂类抗生素的耐药情况较为严重,其中红霉素的耐药率达80.5%, 且多数为高度耐药, 其中59%的菌株MIC为256g/ml,其耐药情况与杭州地区的红霉素的耐药率90.1%、74%的菌株MIC为256g/ml比要低,大环内酯类抗生素的广泛使用可能是造成其耐药率增加的重要原因;,本地区耐药情况,对红霉素、四环素、复方新诺明、 克林霉素和氯霉素的多重耐药情况较为严重,多重耐药发生率为75%,高于北京、上海、杭州地区。,实验室安全防护,根据病原微生物生物实验室生物安全管理条例中的有关规定,肺炎链球菌属于三类,要求在BSL-2实验室操作; 最好在二级生物安全柜中操作;当必须在生物安全柜外处理标本时,需采取面部保护措施(眼镜或护目镜、口罩、面罩、或其他防溅装置),以免传染源或其他有害物溅洒到面上。,谢 谢!,

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