肺炎链球菌检测.ppt

1、肺炎链球菌检测,培养、鉴定、分型,简介,肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）简称肺炎球菌（pneumococcus）。1881年首次由巴斯德（Louis Pasteur）及G. M. Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出。为革兰染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。5%10%正常人上呼吸道中携带此菌。有毒株是引起人类疾病的重要病原菌。,标本中SP形态,形态：矛头状 排列：成双排列 特殊结构：可有荚膜,分布,在自然界中分布广泛，常生活在正常人的鼻咽部，多数不致病或致病力很弱，少数致病力较强。在免疫力

2、下降时致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿，年老体弱者易导致肺部感染。无论从哪种标本中分离出肺炎链球菌，均应及时报告。,国外感染情况,在美国，每年侵袭性SP感染的发生率为72-103/10万儿童，而欧洲为10-24/10万儿童/年。每年约有600多万例中耳炎由SP引起，占急性中耳炎30-50；在发展中国家，每年约有500万5岁以下儿童死于SP引起的肺炎，10-50万儿童死于SP引起的脑膜炎。（2005年）,国内情况,国内最早儿童肺炎链球菌脑膜炎个案报告在1942年。60年代中期以前研究资料显示SP肺炎、脑膜炎在冬春季发病较多，儿科住院病人中常见病例多发生在婴幼儿。SP性脑膜炎占化脑的11.1-

3、22.1，仅次于流脑。SP也是小儿肺炎的重要病原菌之一，SP所致大叶性肺炎，5岁以下儿童中可占70,国内情况,80年代后的研究资料显示SP脑膜炎占同期化脑的79.8。SP引起的败血症还是少见，约占5左右。一项13岁以下儿童中耳炎病原学研究显示SP引起的感染占病例31.7，是最常见的病原菌。,广东地区情况,我院2006年参与惠氏中国住院儿童肺炎流行病学调查研究，从入选的1097例肺炎住院儿童的痰标本中检出肺炎链球菌79例，检出率为7.2%。（中国抗感染化疗杂志）我院2005年-2007年检出313株SP，10株来自血液培养（10/513），脑脊液25株（25/113），中耳炎患儿的炎症分泌物检出

4、26株SP（26/133），来自呼吸道感染患儿的痰或咽拭子标本的SP有252株（252/1412）。（广东医学）,广东地区情况,我院2005-2009年从化脓性脑膜炎患者脑脊液中共检出81株SP（24.18%，81/335）。（临床儿科杂志）我院2011-2012年从中耳炎患者耳分泌物中检出270株SP（36.78%，270/734）。我院2012年从五官科腺样体手术病人的腺样体或扁桃体组织中检出SP104株（40.78%，104/255）。,致病性,在化脓性球菌中，肺炎链球菌的致病力仅次于金黄色葡萄球菌。 肺炎球菌主要的致病物质 有荚膜，肺炎链球菌溶素O，脂磷壁酸和神经氨酸酶等。荚膜具有抗原

5、性，是肺炎链球菌分型的依据。所致疾病 主要引起大叶性肺炎，成人中75%由1,2,3,4,5,7,8,9,12型引起，半数以上为1,2,3型。3型产生大量荚膜物质，毒力强，病死率高。儿童以第6,14,19及23型肺炎链球菌感染最常见.可继发胸膜炎，脓胸，中耳炎，脑膜炎和败血症等。,肺炎链球菌感染的临床症状,在儿童起病多急骤（少数患儿先有轻微的上呼吸道感染症状），中毒症状重。突然高热、体温可达4041，头痛、胸痛、呼吸急促，烦躁不安，早期往往不咳嗽或轻咳，病儿常不吐痰。年长儿可有寒战、咯吐铁锈色痰，但有的患儿仍咳黄脓痰。重症患儿可有惊厥、谵妄及昏迷等中毒性脑病的表现 。,实验室常规检测,标本来源

6、痰、咽拭子、中耳分泌物、血液、脑脊液等。分离培养 血琼脂培养基。初次分离最好提供5%-10%CO2。常规鉴定 Option敏感试验、菊糖发酵试验、胆汁溶菌试验等。,SP培养呼吸道标本的采集,1.抗菌药物使用前取材；2.最好清晨采取痰标本；3.疑似细菌性肺炎患者痰标本每天一次，连续2-3天，不建议24h内多次送检，除非痰液外观性状发生明显改变；4.自然咳痰法取样可用于成人，先应刷牙、清水漱口，量不少于1mL；,SP培养呼吸道标本的采集,5.儿童以支气管镜抽吸为佳，肺泡灌洗液也不错，或者用弯压舌板压舌，棉拭子伸入咽部取样（临床医生操作）；6.其他的经人工气道吸引分泌物、穿刺取样、胃内取样均可以取得

7、合格标本（临床医生操作）。,SP培养呼吸道标本的运输和保存,尽快送检，要求2h内送到；肺炎链球菌延迟送检极有可能死亡，而且不适合4保存；标本处理前检测是否合格。 痰标本合格的标准： 痰标本鳞状上皮细胞 白血球 细菌种类 合格 =10 1-3种 不合格 =25/低倍 3种,培养特性,初次分离需要CO2，采用CO2培养箱较好；18-24h形成细小、圆形、湿润、自溶的菌落，有草绿色溶血环。有少数菌株呈黏液型或颗粒状。最好选用新鲜绵羊血的BAP，有效期应该注意，不像标示的有效期那么长。加庆大霉素的血琼脂平板：在普通血琼脂中加入抑制剂庆大霉素注射液，混匀倾倒平板，琼脂中庆大霉素最后浓度相当于1.25 m

8、g/250mL。,粘液性菌落,SP常见菌落,鉴定,Optochin（乙基羟化奎宁，奥普托新）敏感（生长抑制）试验：在涂布细菌的血琼脂平板上贴5g的Optochin纸片，35有氧环境下过夜，出现14mm的抑菌环为敏感，草绿色链球菌仅小抑菌环或无抑菌环，肺炎链球菌有少数菌株不敏感。 对疑似OP不敏感的肺炎链球菌可用胆汁溶菌试验鉴定。,OP敏感,鉴定,胆盐溶菌试验：滴加胆汁酸盐在血平板上生长的菌落上，置3710-30min，可以看到滴加试剂的部位菌落溶化。 试管法：在0.9mL隔夜培养液中加入0.1mL去氧胆酸钠溶液，37水浴1030分钟，培养液由浊变清为阳性。用生理盐水代替去氧胆酸钠溶液作阴性对照

9、。能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、菊糖等多种糖类，不分解甘露醇、山梨醇。,鉴定,有明显的菌落特征：中心凹陷（自溶）。不典型菌落与其他非溶血链球菌鉴别肺炎链球菌：OP敏感、胆汁溶菌阳性、胆汁七叶苷阴性；草绿色链球菌：三个试验均阴性；牛链球菌：OP和胆汁溶菌阴性，胆汁七叶苷阳性。,SP菌种保存,保存液配制 TSB 3g，甘油25mL，蒸馏水100mL，灭菌后加入无菌马血清100mL，分装在无菌干燥管。保存 挑选新鲜培养物置于保存管中，-76保存。复活 取出保存管自然平衡至室温，接种适合平板。,SP血清学分型：,肺炎链球菌的血清分型可以为肺炎链球菌疫苗研究提供可靠依据，也是一种流行病学调查手段。肺炎链球

10、菌的抗原成分较多，有菌体核蛋白、菌体种属特异性抗原、荚膜多糖抗原等。,SP血清学分型,荚膜多糖抗原：亦称型特异性抗原，存在于肺炎链球菌的荚膜中，由大量多聚体组成，能溶于水，有型特异性，故称之为可溶性特异性物质（SSS）。不同菌株所含荚膜多糖不同，故可用凝集、沉淀和荚膜肿胀试验，进行肺炎链球菌分型。目前至少可将有荚膜的肺炎链球菌分成83个血清型。,血清分型,丹麦Statens Serum Copenhagen公司产pneumotest-kit 23价标准血清分型试剂盒；原理：荚膜肿胀试验；观察：相差显微镜观察最好，可以看到菌体周围有一无色宽厚的环状荚膜。,血清分型,我们的做法：以亚甲蓝染色，普通

11、显微镜可以观察，菌体蓝色，周围有一圈着色较浅的宽的荚膜。,血清分型：,1 细菌复苏：将肺炎链球菌冻存管从-76冰箱取出，挑取3-5L菌液接种于普通羊血培养基，35、5%CO2培养18-24小时，挑取单个菌落做次代培养。2 配制PBS溶液，并分装小试管，每管约0.5mL，用亚甲蓝粉配制0.1的亚甲蓝试剂。,SP血清学分型步骤：,3 用接种环挑取经次代培养后的肺炎链球菌菌落，放入小试管中，制成菌悬液约0.5麦氏单位浓度。4 用接种环挑取约10L菌悬液放入载玻片上，再挑取同量的诊断血清（10l）放入载玻片上，并与菌悬液搅拌混匀。,SP血清学分型步骤：,5 再加入一接种环0.1的亚甲蓝溶液放入载玻片上

12、与抗血清混匀一分钟，盖上盖玻片，在显微镜下观察是否有荚膜或凝集出现。6 出现凝集或荚膜肿胀的抗血清型即为该肺炎链球菌的血清型。,常见的血清型：,常引起人类疾病的血清型20多种，最常见的血清型有：6B、9V、14、19A、19F、23F。国内儿童流行的主要是：6A、6B、23F、19F、14、4、不定型。,国内儿童的血清型流行情况：,7价疫苗和13价疫苗比较,7价疫苗： 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F。13价疫苗： 以上7价加上1, 3, 5, 6A, 7F, 19A。,疫苗涵盖（100）,肺炎链球菌血清型流行趋势,肺炎链球菌的血清型分布随国家和年龄组的变化不大，欧洲国

13、家和美国有着相似的血清型分布，美国的常见血清型依次为6B、19F、23F、14、18C，荷兰常见的血清型分布依次为19F 、6B、6A、9V、23F。亚洲的情况略有不同，韩国以15、14、6B、19F较普遍，而印度以6、14、19、15型较多见。（2006年）,SP的药物敏感性,除万古霉素外，对其他药物均有耐药性菌株出现；对青霉素的耐药不是-内酰胺酶引起，不能用-内酰胺酶试验来预测青霉素的敏感性；青霉素的敏感性可以用1g的苯唑西林（OX）纸片检测，抑菌环20mm，表示对青霉素敏感，对头孢曲松和头孢噻肟也敏感；,肺炎链球菌的药物敏感性,OX抑菌环20mm时应该检测青霉素的MIC；筛选青霉素的耐药

14、性只用1gOX，不能以甲氧西林或青霉素纸片代替，防止假敏感性出现；药敏试验的培养基：加5%脱纤维羊血的MH平板。,敏感性预测,青霉素MIC 能预报对其他-内酰胺类敏感性： 青霉素MIC0.06g/ml（或苯唑西林的抑菌环20mm）提示分离株对氨苄西林（口服或注射）、氨苄西林/舒巴坦、头孢克罗、头孢地尼、头孢托仑、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢唑肟、头孢呋辛、亚胺培南、氯碳头孢和美洛培南等敏感。 青霉素MIC2g/ml 提示对阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松和厄他培南等敏感。,本地耐药情况趋势：,广东地区儿童PRSP低于匈牙利、韩国、台湾，与香港接近，高于上海、北京，表明广州

15、地区儿童鼻咽部肺炎链球菌对青霉素的耐药情况较为严重，且有上升趋势，可能与滥用抗生素，使细菌产生诱导性耐药有关，也可能由于青霉素不敏感克隆株在国内的传播和蔓延。,本地区耐药情况,大环内脂类抗生素的耐药情况较为严重，其中红霉素的耐药率达80.5%， 且多数为高度耐药， 其中59%的菌株MIC为256g/ml，其耐药情况与杭州地区的红霉素的耐药率90.1%、74%的菌株MIC为256g/ml比要低，大环内酯类抗生素的广泛使用可能是造成其耐药率增加的重要原因；,本地区耐药情况,对红霉素、四环素、复方新诺明、 克林霉素和氯霉素的多重耐药情况较为严重，多重耐药发生率为75%，高于北京、上海、杭州地区。,实验室安全防护,根据病原微生物生物实验室生物安全管理条例中的有关规定，肺炎链球菌属于三类，要求在BSL-2实验室操作； 最好在二级生物安全柜中操作；当必须在生物安全柜外处理标本时，需采取面部保护措施（眼镜或护目镜、口罩、面罩、或其他防溅装置），以免传染源或其他有害物溅洒到面上。,谢 谢！,