血凝原理 PPT课件.ppt

1、血凝检测原理,仪器检测原理,凝固法(凝块形成) 发色底物法 (吸光度变化) 免疫比浊法 (乳胶粘合),凝固法 PT,APTT,TT,FIB(PT-Based & FIB- Clauss), Factors II, V, VII, X, VIII, IX, XI, XII,Protein C, Protein S, APC-R, LAC,PCX,HPX 发色底物法 Anti-thrombin,Heparin(普通&低分子), Plasminogen, Plasmin Inhibitor, 免疫比浊法 D-Dimer, vWF（活性及含量）, Free Protein S，VIII含量，HS-CR

2、P 正在研发的实验项目：,仪器检测项目,Photo-optic method:IL instrumentation,From ACL 100 ACL Futura ACL Topto ACL 10000 ACL Advanceto ACL Elite 凝固法 660 880 671 散射比浊 透射比浊 透射比浊发色底物法 405 405 405 吸光率 吸光率 吸光率乳胶 凝集试验 405 405 405 or 671 Electra = 550 for clotting and 405 for chromogenic,测量浊度的变化它并不是一种由于颜色变化引起的吸收值的变化（区别于发色底物法

3、)为了避免干扰（胆红素，血红蛋白），通常选择高波长进行检测,凝固反应,光学检测法,胆红素,血红蛋白,乳糜,胆红素，血红蛋白和乳糜在检测时吸收峰位置,波长,ACL,Other,Other,凝固法检测史,手工法检测,反应在试管内发生(37 C水)凝块形成，操作人员肉眼可见操作人员记录时间,手工法检测,血凝常规检测,血浆或稀释血浆 (37C孵育) + 试剂 (预加热 37C)-纤维凝块形成-纤维凝块形成所需时间,所有的凝固反应均为纤维凝块形成过程的检测如: PT, APTT, Fibrinogen Clauss, 因子检测, 等,纤维蛋白凝块检测,持续检测光密度变化 (透射法或散射法）凝固时间由数学

4、运算法则决定 (域值, 第一演算法,第二演算法等),光学法检测,最经典的运算法则:阈值，正好能产生特定效应的界限（反应浊度的变化) 第一法则 (反应速度) 第二法则 (反应加速度),仪器的运算法则决定反应时间,运算法则: 阈值法,Time,凝固点,浊度或光散射值,阈值法（凝固起始点）,浊度阈值法用于 (曲线delta的绝对值或百分比)允许识别凝固点,应用于下列情况:Example: 纤维蛋白原Clauss; delta信号弱, 当FIB浓度高时，曲线上升快，而浓度低时曲线上升缓慢。在某些标本中逆向检测的阈值用于曲线的末端是非常平坦的。,阈值法,运算法则: 阈值法,Time,凝固点,一阶导数法,

5、It is established that the maximum speed of the reaction represents the clot point,浊度或光散射值,运算法则: 一阶导数法,一阶导数的真实表现,运算法则: 一阶导数法,用于以下情况:基线不总是平坦的 通常情况下，反应速度快凝固曲线信号清晰，纤维蛋白形成过程中没有起伏凝固的时间较长 (与阈值法或二阶导数法比较),一阶导数,运算法则: 一阶导数法,应用于以下情况:Example: Recombiplastin; 凝固曲线上升很快, 凝固曲线的形状清晰, 凝固时间较长 (与阈值法或二阶导数法比较)一阶导数的曲线总是正的

6、 (or zero),一阶导数,运算法则: 一阶导数法,Time,凝固点,二阶导数,反应的最大加速度点,运算法则: 二阶导数法,浊度或光散射值,二阶导数法的真实表现,运算法则：二阶导数法,用于以下情况:基线不总是平坦的通常情况下反应加速度快凝固曲线信号清晰，在基线和凝块形成期无起伏该运算法则主要应用于凝固反应试验(i.e. APTT type),二阶导数法,运算法则: 二阶导数法,通常应用于下述情况:Example: APTT; 凝固曲线相对清晰，反应加速度快， 曲线外观没有大的起伏。二阶导数曲线可正可负。,二阶导数,运算法则: 二阶导数,实际上，大部分凝固反应运算使用的是二阶导数。少许情况下

7、使用一阶导数。其它一些反应使用阈值法更合适。不同的运算法则由不同的试验所选择。,一种完善的算法是否存在 ?,凝固曲线,发色底物法,发色底物试验的基本反应是：未稀释血浆或稀释后血浆(incubated at 37C) + 试剂 (酶)-中间复合物+ 试剂(底物)剩余的酶能水解特殊的底物， 去除pNA 分子，产生颜色反应。,发色底物试验,发色底物法(如：抗凝血酶试验),AT + Heparin,AT*Heparin,AT*Heparin + FXa (excess),AT-FXa- Heparin + FXa (residual),Chromogenic substrate,FXa (residu

8、al),Peptide + pNA,标本与肝素（外源性）一同孵育。过量的FXa 加入。过量的FXa水解加入的底物。pNA产生。,Chromogenic Method,pNA呈黄色，随后被分光光度计测量 (at 405 nm).测量值与定标曲线比较得出浓度值。,发色底物法,Antithrombin:Neat plasma 100%, diluted at 50 % and 25%,发色底物法,AT Linearity,免疫比浊法，二聚体检测,免疫学方法,D-Dimer Curve,典型的曲线像一个大的S有一个初始的基线，一个上升阶段和一个终点 (平台期),反应曲线,反应曲线,时间,初期; 凝血因

9、子激活期,纤维蛋白原正在转化为纤维蛋白,平台期; 所有的纤维蛋白原均已转化为纤维蛋白,吸光度变化,凝固曲线和反应曲线是一个良好的工具 。,这种工具为确保可靠的结果提供保障，既节省时间，又节省费用。,结论：,a,b,g,纤维蛋白的形成过程,Fibrinogen is composed of 3 chains,the formula is: 2(a,b,g),纤维蛋白的形成过程,纤维蛋白原转变为纤维蛋白通过三个步骤,1. 蛋白水解(通过凝血酶),凝血酶水解纤维蛋白肽,纤维蛋白单体,纤维蛋白的形成过程,2. 纤维蛋白单体自发聚合,纤维蛋白的形成过程,2. 纤维蛋白单体自发聚合,纤维蛋白的形成过程,2

10、. 纤维蛋白单体自发聚合,纤维蛋白的形成过程,Fibrin fibre,2. 纤维蛋白单体自发聚合,纤维蛋白的形成过程,2. 纤维蛋白形成纤维蛋白网,Fibrin net,纤维蛋白的形成过程,3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白,XIII,Thrombin,纤维蛋白的形成过程,XIII,Thrombin,3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白,纤维蛋白的形成过程,XIIIa,Thrombin activates FXIII,3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白,纤维蛋白的形成过程,XIIIa,3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白,纤维蛋白的形成过程,XIIIa,3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白,XIIIa,FXIIIa

11、stabilises fibrin by introducing covalent bonds,3.通过铰链形成稳定的纤维蛋白,纤维蛋白的形成过程,PT衍生纤维蛋白原（PT based FIB ）Clauss法纤维蛋白原（Clauss FIB）,ACL系列凝血仪纤维蛋白原检测,FIB的检测方法,PT based FIB的基本原理基于PT反应曲线光学差值与FIB浓度的线性关系,浓度,FIB的检测方法,Clauss法FIB的基本原理,首选Clauss方法NCCLS推荐如考虑测试成本，可选用PT based FIB做常规筛查，超出200-400mg/dL范围样品及OAT病人样品用Clauss法复查,FIB方法使用建议,Clause 方法与PT 衍生法结果比较口服抗凝药病人,标本: 411 正常人, 50 位口服抗凝药病人方法: Clauss 和PT 衍生法结果: Clauss PT derived 正常人 320124 289126 (mg/dl)口服抗凝药病人421154 487194 (mg/dl)口服抗凝药病人PT 衍生法结果比 Clause 法高24%,谢 谢,