多糖类药物的分析.ppt

1、1,多糖类药物的分析,一、概述二、多糖的纯度测定三、多糖分子量测定四、多糖的含量测定五、多糖类药物的结构分析,2,活性多糖,动物,植物,微生物,海洋生物,肝素硫酸软骨素,黄芪多糖枸杞多糖,香菇多糖灵芝多糖右旋糖苷,海洋真菌多糖螺旋藻多糖,第一节 概述: 多糖的分类-来源,微生物来源,细菌产生的典型胞外多糖有：右旋糖酐、果聚糖及荚膜多糖等。右旋糖酐(Dextran)，又名葡聚糖，是最早发现的微生物多糖，也是世界上第一个工业化的微生物多糖。右旋糖酐是蔗糖经肠膜状明串珠菌产生的右旋糖酐蔗糖酶催化后生成的高分子葡萄糖聚合物。右旋糖酐注射液可作为抗血栓药（抗血小板）降低血液黏性，在贫血症方面用于扩增血容

2、量。细菌荚膜多糖的临床应用多为疫苗，其对肺炎和流行性脑膜炎的预防效果十分显著。该多糖一般以25种单糖连接形成的糖链为重复单位，在长链状多糖结构的主链上常常带有支链。,3,4,5,组成分类：,均一多糖不均一多糖粘多糖：含氮的不均一多糖结合糖：肽聚糖、脂多糖、糖蛋白(glycoproteins)和蛋白聚糖糖蛋白通过糖肽键(carbohydrate-peptide linkage)将糖链和肽链两部分连接起来,连接方式主要分为-构型的N-糖苷键和-构型的O-糖苷键.,6,糖蛋白有三种主要类型,糖蛋白分为三种主要类型：O-糖苷键型糖蛋白、N-糖苷键型糖蛋白和连有磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白。在大多数的O-糖

3、苷键型糖蛋白中，GalNAc残基通过O-糖苷键与一个丝氨酸或苏氨酸残基连接形成，缩写为GalNAc-Ser/Thr。在N-糖苷键型糖蛋白中，GlcNAc残基通过N-糖苷键与一个天冬酰胺残基相连，缩写为GlcNAc-Asn。,7,O-糖苷键,N-糖苷键,O- （N-）糖苷键型糖蛋白,8,磷酸乙醇胺残基,磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白,9,蛋白聚糖,软骨蛋白聚糖:聚集体的分子量非常大（大约为2108），其中含有透明质酸、硫酸角质素、硫酸软骨素、连接蛋白、核心蛋白和大量的寡糖链。,10,六员环糖类似于吡喃，所以又称之为吡喃糖，而五员环糖类似于呋喃，称之为呋喃糖。 环化单糖中氧化数最高的碳称为异头碳。在环式

4、结构中，异头碳是手性碳，所以环化的醛糖或酮糖可以呈现两种异头构型中的一种，即-或-构型。,吡喃,呋喃,多糖组成-单糖,11,葡萄糖环状结构,12,椅式构象,-D-葡萄糖 -D-葡萄糖,13,直链淀粉是葡萄糖以-1，4糖苷键结合成的链状化合物,直链淀粉,14,纤维素,15,多糖的理化性质,旋光性 硫酸蒽酮反应（620nm）硫酸苯酚反应(490nm)氨基己糖乙酰丙酮(525nm)糖醛酸硫酸咔唑(520nm),16,第二节 多糖的纯度测定,（一）超离心法: 单一区带（二）电泳法： 单一色带（三）凝胶色谱法： 单一洗脱峰（四）旋光法： 均一组分,17,第三节 多糖的分子量测定,凝胶色谱法粘度法高效液相

5、色谱电泳法质谱法,18,凝胶层析法,凝胶层析法：将分子量不同的蛋白质通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离。最先淋出的是最大的分子。Kd = 0， Ve= V0 ；Kd = 1 ， Ve= V0+Vi ；0Kd1，Ve=V0+KdVi 。,19,凝胶色谱法,方法：Sephadex G-200，多糖标准品分部收集，硫酸-苯酚检测，分别求得洗脱体积Ve， Ve与 1gM之间存在着线性关系，绘制标准曲线。 Ve=-KlogM+C将待测样品上柱，待测多糖Ve。通过标准曲线求出待测多糖分子量。,20,粘度法、超离心法,粘度法：用已知结构相似的多糖决定K值（ K M

6、2），然后测出待测多糖的特性粘数 ，计算待测多糖的分子量。超离心法：根据测得的沉降系数计算多糖的平均分子量。,21,高效液相色谱法测定分子量及分布,色谱条件： 凝胶柱（分子量大小），示差折光检测器。标准曲线： 标准曲线：LogMW = a+b tR MW为重均分子量，tR为保留时间待测多糖分子量（GPC专用软件）： 重均分子量 Mw=(RIiMi)/ RIiMi为供试品在保留时间ti 时的分子量，RIi在第i部分中被洗脱物质的量（重量）。,电泳法,随着电泳技术的发展，高效毛细管电泳（HPCE）越来越多地应用于多糖类化合物的分离分析中，此法所需样品量小、分析速度较快且可同时分析多个样品。对于带有

7、电荷的多糖可直接进行电泳分析，而不带电荷的多糖也可通过酸性荧光标记试剂衍生后进行电泳分析。将待测样品与已知分子量的一系列标准品的电泳结果进行比对，可得出待测样品的分子量。,22,质谱法,质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质量与所带电荷比（m/z)的差异来分离并确定相对分子质量，是目前测定相对分子质量最精确的方法。电喷雾离子化（electro spray ionization，ESI）技术基质辅助激光解析电离（matrix-assisted laser desorption ionization）飞行时间质谱（time of flight mass spectrometry，T

8、OFMS）傅里叶变换质谱（fourier transform mass spectrometry，FTMS）,23,24,第四节、多糖的含量测定,比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法）生物测定法（肝素钠）生色底物法（低分子量肝素钠）高效液相法（硫酸软骨素）,25,乙酰丙酮法（elson-morgan）氨基己糖,原理：氨基己糖在碱性条件下加热，可与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物，该衍生物与对二甲氨基苯甲醛反应，反应物呈红色，于525nm测定吸收度。,26,硫酸咔唑法测糖含量,硫酸咔唑法己糖醛酸测定在浓硫酸中，己糖醛酸与咔唑溶液反应生成的反应物呈红色。 520nm比色,27,硫酸苯酚法测定

9、糖含量（总糖）,原理：多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，该单糖在强酸性条件下，与苯酚反应生成橙色衍生物。它在490nm处有最大吸收，其吸光度与浓度呈线性关系。,28,蒽酮法测定糖含量（总糖）,原理：多糖在浓硫酸中水解后，进一步脱水生产糠醛类衍生物，与蒽酮作用形成蓝色化合物，620nm进行比色测定。特点：10-100g范围内其颜色的深浅与糖含量成正比。灵敏度高。,29,生物测定法肝素测定,美国药典采用羊血浆法。即比较肝素标准品和供试品延长血浆凝结时间的作用来测定肝素的效价。,30,生物测定法肝素测定方法,标准品稀释液的配制:精密量取标准品溶液，按高、中、低剂量组（ ds1 、ds2、 ds3 ）用0

10、.9%氯化钠溶液配成三种浓度的稀释液，相邻两浓度的比值为1:0.7。供试品稀释液的配制：按供试品的标示量或估计效价（AT），照标准品溶液与稀释液的配制法配成高、中、低（ dT1 、dT2、 dT3 ）三种浓度的稀释液。各管凝结时间换算成对数，照生物检定统计法中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。可信限率（FL%）不得大于5%。,31,生色底物法原理肝素、低分子肝素,当蛋白酶（Fa）从生色底物分裂出pNA时，发色物的产生量与剩余的酶量成正比，与肝素效价成反比。405 nm测定。,32,生色底物,Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰， Tos：甲苯磺酰；对-硝基苯胺（pNA）。酰胺分解法（amidol

11、ytic method）。当蛋白酶从生色底物分裂出pNA时，发色物的产生量与剩余的酶量成正比，与肝素效价成反比。 405 nm测定。,33,生色底物法,抗Xa因子活性测定 以溶液吸收度和浓度的对数，照生物检定统计法中量反应平行线测定法计算出供试品的抗Xa因子活性 可信限率(FL%)不得大于10%。,高效液相色谱法,糖类化合物一般缺乏特征的紫外吸收，为提高其在高效液相色谱检测中的灵敏度，常常采用衍生的方法使其成为具有紫外或荧光吸收的衍生物，再进行检测。包括柱前衍生-HPLC荧光标记-HPLC柱后衍生-HPLC直接HPLC和离子交换色谱法如2015版中国药典中，采用离子交换色谱法对硫酸软骨素进行含

12、量测定，并以外标法计算待测样品含量。,34,35,色谱条件与系统适用性试验 用强阴离子交换硅胶为填充剂（如Hypersil SAX柱，250 mm 4.6 mm，5 m），以水为流动相A，以2 mol/L氯化钠溶液（为流动相B；流速1.0 ml/min，检测波长232 nm。组分流出顺序为硫酸软骨素B、硫酸软骨素C和硫酸软骨素A，三者色谱峰的分离度均应符合要求。含量测定法 取待测品约0.1 g，精密称定后置10 ml容量瓶中加水溶解并稀释至刻度，摇匀，0.45 m滤膜过滤，精密量取100 l，置具塞试管中，加三羟甲基氨基甲烷缓冲液800 l，充分混匀，再加入硫酸软骨素ABC酶液100 l，摇匀

13、，置于37水浴中反应1 h，取出，100加热5 min，用冷水冷却。离心（10000 rpm）20 min后分取上清液，以0.45 m滤膜滤过，精密量取20 l注入色谱仪，记录色谱图。另取硫酸软骨素钠对照品适量，精密称定，同法测定，按外标法以硫酸软骨素A、硫酸软骨素B与硫酸软骨素C的峰面积之和计算，即得。,36,第五节、多糖类药物的结构分析,单糖组成糖苷键连接方式糖苷键连接位置,37,2个相同单糖连接形成的双糖有11种,2个相同氨基酸连接形成的二肽仅1种,二肽与双糖,38,（一）多糖组成单糖的分析,1、水解方法（1）、完全酸水解法（2）、部分酸水解、碱水解（3）、乙酰解（4）、甲醇解（5）、酶

14、降解2、鉴定,39,（1）、完全酸水解法,水解难易取决单糖性质及构型。呋喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易水解，型较型易水解。已聚糖一般用1 mol/L硫酸，70，8小时。氨基葡聚糖为4 mol/L盐酸，100 9小时。,40,（2）、部分酸水解、碱水解选择温和的条件水解多糖，使糖链中某种类型的键特异性地打断。（3）、乙酰解多糖经过乙酰解反应（醋酐、冰醋酸）可生成乙酰化单糖和寡糖,41,（4）、甲醇解,多糖链在80100条件下与无水甲醇反应能将糖链变成组成单糖的甲基糖苷。甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，进行气相色谱分析。,42,（5）、酶降解,分为外切糖苷酶和内切糖苷酶。外切糖苷酶：切

15、下多糖非还原末端的一个单糖，并对单糖组成和糖苷键有专一性要求。内切糖苷酶可水解糖链内部的糖苷键，释放多糖链片断以利于结构分析。,43,2、单糖的分离鉴定,气相色谱法高效液相色谱法气相色谱法与质谱分析连用,44,气相色谱法,常用的衍生物有： 三甲硅烷（TMS）衍生物 三氟乙酰（TEA）衍生物 乙酰（AC）衍生物 甲基（Me）衍生物,45,二、糖苷键连接方式的测定,红外光谱糖苷键类型确定吡喃糖糖苷键时，用红外光谱，在890cm-1处有特征吸收者，示有-型糖苷键，在840cm-1处有特征吸收者，示有-型糖苷键。核磁共振谱糖苷键（型或型）。H-NMR谱中的化学位移5.4 和 5.1 ，有两个信号说明分

16、子结构中的糖苷键为型，如有 4.53说明有型。,46,三、糖苷键连接位置的测定,（一）、高碘酸氧化、Smith降解（二）、甲基化反应产物分析（三）、乙酰解后质谱分析,47,（一）高碘酸氧化、Smith降解,原理：选择性的氧化降解反应，能够作用于多糖分子中1，2二羟基和1，2，3三羟基，生成过碘酸氧化产物；此产物用硼氢化钠还原后，再用酸水解，生成相应的醛、甲酸。室温下用稀无机酸水解还原产物。,48,1，2连接的糖苷键,1，2连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原得到稳定的多羟基化合物，再用稀盐酸水解，得到甘油及甘油醛。方程式：,49,1，3连接的糖苷键,1，3连接的糖苷键与高碘酸不起反应

17、，经还原与水解后得到原来的单糖。方程式：,50,1，4连接的糖苷键,1，4连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原，用稀盐酸水解得到最终产物为赤藓醇和乙醇醛。,51,1，6连接的糖苷键,1，6连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原得到稳定的多羟基化合物，再用稀盐酸水解，得到甘油及乙醇醛。,52,（二）甲基化反应产物分析,原理：多糖经甲基化试剂作用使分子中的羟基甲基化，然后用甲酸和三氟醋酸水解，以气相色谱鉴定甲基化水解产物。如多糖分子中带有支链，甲基化水解后可生成二甲基单糖。,53,（三）乙酰化后质谱分析,原理：多糖经过乙酰化反应（醋酐、冰醋酸）生成乙酰化单糖和寡糖。用氯仿抽提，蒸

18、去氯仿，进行质谱分析。分子离子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰单糖碎片峰，表明有支链结构。,54,2015年版中国药典收载的多糖类药品,55,实例：右旋糖酐（dextran）,右旋糖酐，又称葡聚糖，是若干个葡萄糖脱水形成的聚合物。微生物多糖，也是第一个工业化的微生物多糖，是由肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）发酵产生的。产物的分子量很大，经水解后，用不同浓度乙醇多定分级沉淀，得到中、低、小分子量的右旋糖酐成品。临床上使用的是平均分子量为1600024000，3200042000和6400076000的右旋糖酐20、右旋糖酐40和右旋糖酐70，它们均是用做代血浆。,56

19、,一、结构与理化性质,右旋糖酐的结构：它主要由葡萄糖（16）-糖苷键连接而成，同时含有(13)-和(14)-糖苷键连接形成的分支结构。右旋糖酐为白色无定形粉末，无臭、无味，易溶于热水。右旋糖酐溶于水后形成有一定粘度的胶体溶液，在乙醇等有机溶剂中不溶。,57,二、鉴别,右旋糖酐经碱性水解后产生葡萄糖，葡萄糖可使Cu2+还原为红色氧化亚铜沉淀。操作方法：取本品0.2 g，加水5 ml溶解后，加氢氧化钠试液2 ml与硫酸铜试液数滴，加热后变成红棕色沉淀 。,58,三、检查,右旋糖酐的检查项目较多，其中氯化物、重金属、干燥失重、炽灼残渣的检查参见中国药典2015年版二部附录，此外还有氮、分子量与分子量

20、分布的检查。氮:用发酵法制备右旋糖酐时，发酵滤液中存在着微量蛋白质。,59,氮,取本品0.2 g，置50 ml凯氏烧瓶中，加硫酸1 ml，加热消化至供试品成黑色油状物，放冷，加30%过氧化氢溶液2 ml，加热消化至溶液澄清，冷却至20以下，加水10 ml，滴加管中，再用水稀释至刻度，缓缓加碱性碘化汞钾试液2 ml，随加随摇匀；如显色，与标准硫酸铵溶液(每1 ml相当于10 g的N)1.4 ml加硫酸0.5 ml用同一方法处理后颜色比较，不得更深(0.007%)。,60,分子量与分子量分布,右旋糖酐20： 3500 7万右旋糖酐40： 5000 12万右旋糖酐70： 15000 18.5万,61

21、,四、含量测定,旋光光度法，根据右旋糖酐水溶液的旋光度在一定范围内与浓度成正比来测定含量。以右旋糖酐40氯化钠注射液的含量测定为例。取本品10 ml，置50 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，照旋光度测定法测定，按下式计算右旋糖酐的含量C=0.5128C为每100 ml注射液中含有右旋糖酐的重量；为测得的旋光度稀释倍数。,肝素,本品应从检疫合格的猪或牛肠黏膜中提取，生产过程均应符合现行版药品生产质量管理规范要求。生产工艺要经病毒灭活验证，并能去除有害的污染物，生产过程中应确保不被外来物质污染。【性状】本品为白色至类白色的粉末；极具引湿性。本品在水中易溶。比旋度 取本品，精密称定，加水溶解并定

22、量稀释制成每l ml中约含40 mg的溶液，依法测定（附录VI E)，比旋度应不小于+ 50。,62,【鉴别】（1）在有关物质项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。（2）本品的水溶液显钠盐的鉴别（1）反应（附录III）。,63,【检査】总氮量 取本品， 照氮测定法（ 附录VII D 第二法）测定，按干燥品计算，含总氮量应为1.3%2.5%。酸碱度 取本品0.10 g，加水10 ml溶解后，依法测定（附录VI H），pH值应为5. 07 .5。溶液的澄清度与颜色 取本品0.50 g，加水10 ml溶解后，溶液应澄清无色；如显浑浊，照紫外-可见分光光度法（附

23、录IV A)，在640 nm的波长处测定，吸光度不得大于0.018；如显色，与黄色1号标准比色液（附录IX A第一法）比较，不得更深。吸光度 取本品，加水制成每l ml中含4 mg的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录IV A）测定，在260nm的波长处，其吸光度不得大于0. 10；在280nm的波长处，其吸光度不得大于0.10。,64,有关物质 取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每l ml中约含20 mg的供试品溶液；取肝索钠对照品与硫酸皮肤素对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每l ml中各约含肝素钠20 mg和硫酸皮肤素l mg的混合溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法

24、（附录V D)测定，以烷醇季铵为功能基的乙基乙烯基苯-二乙烯基苯树脂为填充剂（如AS11阴离子交换柱，2mm 250mm，与AG11保护柱，2mm 50mm)；以0. 04%磷酸二氢钠溶液（用磷酸调节pH值至3.0）为流动相A；以高氯酸钠-磷酸盐溶液（取高氯酸钠14g，用0. 04%磷酸二氢钠溶液溶解并稀释至100 ml，用磷酸调节pH值至3.0）为流动相B；流速为每分钟 0.22 ml；检测波长为202 nm。取系统适用性试验溶液（取硫酸皮肤素对照品、多硫酸软骨素对照品与肝素钠对照品适量， 加水溶解并制成每l m l 中各含硫酸皮肤素0. 02 mg、多硫酸软骨素0. 02 mg和肝素钠20

25、 mg的混合溶液）10 l，注人液相色谱仪，记录色谱图，硫酸皮肤素、肝素钠与多硫酸软骨素的保留时间分别约为20分钟、30分钟和50分钟。硫酸皮肤素峰与肝素钠峰的分离度应大于1.0，肝素钠峰与多硫酸软骨索峰的分离度应大于1.5。精密量取供试品溶液和对照品溶液各10 l，分别注人液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，硫酸皮肤素的峰面积不得大于对照品溶液中的硫酸皮肤素的峰面积（5.0 %）；肝素钠主峰后其他杂质峰按面积归一化法计算，应不得大于3.0 %。,65,残留溶剂 干燥失重 取本品，置五氧化二磷干燥器内，在60减压干燥至恒重，减失重量不得过5.0%（附录VIII L）。炽灼残渣

26、 取本品0.50 g，依法检査（附录VIII N），遗留残渣应为28.0 % 41.0 %。钠 精密称取本品约50 mg，置100ml量瓶中，加0.l mol/L的盐酸溶液(每l ml中含氯化铯1.27 mg)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取钠单元素标准溶液（每l ml中含Na+200 g，用上述盐酸溶液定量稀释并分别制成每l ml中含Na+ 25 g，50 g，75 g的对照品溶液。取对照品溶液与供试品溶液，照原子吸收分光光度法（附录IV D第一法），在330.3 nm的波长处测定，以干燥品计算，含钠应为9.5%12.5%。重金属 取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查（附录VI

27、II H第二法），含重金属不得过百万分之三十。细菌内毒素 取本品，依法检查（附录XI E )，每1单位肝素中含内毒素的量应小于0.010 EU。,66,【效价测定】照肝素生物测定法（附录XII D）测定，应符合规定；测得的结果应为标示量的91%110%。对肝素钠的检查项目较多：包括溶液的颜色与澄清度、酸碱度、吸光度、残留溶剂、干燥失重、炽灼残渣、重金属、总氮量、钠、细菌内毒素以及有关物质检查等，其中残留溶剂、干燥失重、重金属、炽灼残渣等属于生物药物的一般杂质检查项目。考虑到肝素钠的自身特点，在检查项目中还包括：对吸光度的测定，检查肝素钠中混入蛋白质和核酸等大分子杂质的情况；对总氮量的检查，目的

28、是控制肝素钠中可能引入的杂蛋白含量；对钠含量的检查，也是反映肝素钠纯度的指标之一；对有关物质的检查，采用高效液相色谱法，分析肝素钠中是否含有硫酸皮肤素等相关杂质，并规定了所含杂质的限度。,67,68,第三节 多糖的分子量测定,凝胶色谱法粘度法超离心法高效液相色谱重均分子量,69,四、多糖的含量测定,比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法）生物测定法（肝素钠）生色底物法（抗Fa 活性）,70,第五节、多糖类药物的结构分析,单糖组成糖苷键连接方式糖苷键连接位置高碘酸氧化、Smith降解,71,本章内容小结,第十章多糖类药物分析,1.多糖的纯度与分子量测定,2.多糖含量测定,3.多糖结构分析,1.了解多糖的分类与理化性质2. 多糖的纯度及分子量测定方法,1.了解多糖含量测定总的方法2.掌握比色法3.掌握肝素钠检测的生物测定法和生物底色法,1.单糖的组成2.糖苷键连接方式3. 糖苷键连接位置,72,复习思考题,多糖的分类有哪些？多糖理化性质如何，并如何应用与多糖检测？多糖纯度及分子量测定有哪些方法？多糖的含量测定有哪些方法？多糖类药物的结构分析主要包括哪些内容？ 术语：均一多糖，不均一多糖，粘多糖，糖蛋白，蛋白聚糖，硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法，生物测定法（肝素钠），生色底物法（低分子量肝素钠），高碘酸氧化，Smith降解,