抗性淀粉及总淀粉测定方法.doc

1、抗性淀粉及总淀粉测定方法采用 Megazyme 抗性淀粉试剂盒法，测定方法见试剂盒说明书（下附）原理（AOAC 法 2002.02 ;AACC 法 32-40）抗性淀粉的测定方法： 样品使用 -胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）37 振荡水浴孵育 16 小时，在这期间，通过两种酶的联合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成 D-葡萄糖，孵育结束后，加入等体积的乙醇或工业甲基化酒精（IMS,变性乙醇）终止反应。离心上述溶液，收集上清勿弃，底部残留絮状团即为样品中的 RS，用含水的 IMS 或乙醇（50%v/v）洗涤絮状团，洗涤后离心，再重复一次洗涤离心，收集离心后获得的上清，与之前收集的上清混合。小心倒出

2、试管残留的液体，将絮状团置于冰水浴中，加入 2M KOH 溶解，溶解的同时用磁力搅拌机剧烈搅拌。用醋酸盐缓冲液将这个溶液调至中性，用 AMG 将淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂（GOPOD）测定，这也是对样品中 RS 含量的测定。非抗性淀粉（可溶性淀粉）的测定可通过集中的上清液并定容至100mL，再用 GOPOD 测定 D-葡萄糖完成。总淀粉测定方法：即抗性淀粉与非抗性淀粉总和。抗性淀粉检测试剂盒K-RSTAR （100 次分析）应用性和精确性这个方法需要样品中 RS 含量多于 2% w/w。如 RS 含量多于 2% w/w，常规标准误差为5%。少于 2% w/w

3、RS 的误差更高。试剂盒瓶子 1：淀粉葡糖苷酶 AMG，12 mL，3300U/ mL，条件为 pH4.5，40 下，底物为可溶性淀粉，单位或为 200U/mL，条件为 pH4.5，40下，底物为对硝基苯基 -麦芽糖苷。AMG 溶液应完全没有可检测到的游离 D-葡萄糖。4下稳定性 3 年。瓶子 2：-胰淀粉酶(胰酶， 10g，3Ceralpha U/mg)。4下稳定性 3 年。瓶子 3：GOPOD 试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液（1M ，pH7.4） ，对羟基苯甲酸（0.22M）和叠氮化钠（0.4%W/V） 。4 下稳定性 3 年。瓶子 4：GOPOD 试剂酶。葡糖氧化酶（12,000U）加上过氧化

4、物酶（650U）和 4-氨基安替比林（80mg） 。冻干粉，-20下稳定性5 年。瓶子 5：D-葡萄糖标准溶液（5 mL,1.0mg/mL）溶于苯甲酸 0.2%（w/v） 。室温下稳定性5年。瓶子 6：抗性淀粉对照。抗性淀粉含量如表所示。室温下稳定性5 年。溶液/悬浮液的制备1.使用瓶子 1 中提供的的产品（AMG；溶液 1） 。这个溶液是有粘性的，因此应使用正向移液器移取分装。4下稳定性 3 年。稀释 AMG（300 U/ mL） 。取 2 mL 瓶子 1 中的 AMG 浓缩液用 0.1M 顺丁烯二酸钠缓冲液（0.1M，pH6.0；试剂 1，非提供）稀释至 22mL。以 5 mL 为单位分装

5、后用聚丙烯管冷冻保存。反复冻融不会影响稳定性，稳定性-205 年。用前制备2.用 100mL 顺丁烯二酸钠 缓冲液 (100mM，pH6.0；试剂 1，非提供)悬浮 1g 瓶子 2 中的产品(-胰淀粉酶 )，搅拌 5 分钟。加入 1.0mL 稀释的 AMG（300 U/ mL） ，混匀。1500g 离心 10 分钟，慢慢倒出上清液，这就是制备的溶液 2。溶液 2 制备后应当天使用。3.用蒸馏水稀释瓶子 3 中的产品（GOPOD 试剂缓冲液）稀释至 1L，这就是制备的溶液 3。制备后马上使用。备注：（1 ）如果浓缩缓冲液在-20下储存，它将形成结晶盐，因此必须要完全溶解才可以用蒸馏水稀释。（2

6、）这个缓冲液包含 0.4%（ w/v）的叠氮化钠。因此这是个有毒化学物，应进行相应的处理。4.取瓶 3 中制备好的溶液 320mL 溶解瓶子 4 里全部的产品，定量转移这个溶液至装有剩余溶液 3 的瓶子中。用铝箔封盖瓶子以遮光。这就是葡萄糖测定试剂（GOPOD 试剂） ，可以在 2-5保存 3 个月或者-20下保存一年。如果试剂要以冷冻态储存，应分装后再冻存。当试剂是新鲜制备的，它的颜色应是浅黄色或浅粉色。在 4储存 2-3 个月时会演变成深粉色。当以蒸馏水为对照时，这个溶液的吸光度应小于 0.05。5&6.使用瓶子 5 或 6 提供的产品。室温下稳定性5 年。没有提供的试剂（应购买分析纯级）

7、1.顺丁烯二酸钠（马来酸钠）缓冲液(100mM，pH6.0)加上 5mM 二水氯化钙和叠氮化钠（0.02%w/v） .用 1600mL 蒸馏水溶解 23.2g 顺丁烯二酸，用 4M（160g/L）氢氧化钠调节 pH 至 6.0，加入 0.74g 二水氯化钙和 0.4g 叠氮化钠，并溶解。定容至 2L。4下可保存一年。2.醋酸钠缓冲液（1.2M，PH3.8 ）将 69.6mL 的冰醋酸（1.05g/mL）加至 800 mL 的蒸馏水中，用 4M 氢氧化钠调节 pH至 pH3.8。用蒸馏水定容至 1L，室温下可保存一年。3.醋酸钠缓冲液（100mM，PH4.5）将 5.8mL 的冰醋酸加至 900

8、 mL 的蒸馏水中，用 4M 氢氧化钠调节 pH 至 4.5。用蒸馏水定容至 1L，4保存 2 个月。4.氢氧化钾溶液（2M ）将 112.2gKOH 加至 900 mL 的去离子水中，搅拌溶解。定容至 1L，密封保存。室温下可保存 2 年。5.含水乙醇（或者 IMS） （大约 50%v/v）将 500mL 乙醇（95%v/v 或者 99%v/v）或者工业甲基化酒精（IMS；变性乙醇；95% v/v 乙醇加上 5%甲醇）至 500mL 的水中。密封保存，室温下稳定保存2 年。备注：一系列包含 RS 的对照样品 0.6%-78%w/w 可从 Megazyme 公司购买。设备（推荐）1. 离心式粉

9、碎机，带有齿轮转子和 1.0mm 筛子，或类似的装置。小型样品可选择旋风磨碎机替代。2.绞肉机-手动或电动的，装有 4.5mm 筛。3.台式离心机-能够放入 16120mm 玻璃试管，速度大约 1500g(3000rpm)4.振荡水浴器，可设定为每分钟 100 次直线运动（振荡速度为每分钟 200 里程） ，振荡距离 35mm,37。5.水浴锅-能够保持在 50+0.1。6.涡旋混匀器。7.磁力搅拌器。8.磁力搅拌棒-515mm。9.pH 计10.计时器11.分析天平（精确到 0.1 毫克）12.分光光度计-能够设定 510nm（10mm 路径长度）13.100L 移液器及一次性枪头14.连续

10、分配器-配有 50mL 管嘴，能够移取 2.0mL，3.0mL 和 4.0mL。15.培养管-螺旋帽，16125mm16.玻璃试管-16100mm，14mL 容量17.塑料盒，可放置试管架，也可作为冰盒使用。18.温度计-能够读取 37+0.1和 50+0.1。19.容量瓶-100mL，200 mL，500mL，1 L，2L样品制备用磨碎机研磨大约 50g 谷物样品或冻干植物或食品，使样品粉末可过 1.0mm 筛。转移所有的材料至广口瓶，颠倒振荡混匀。工业淀粉一般不用研磨。用绞肉机粉碎鲜样（如罐装的豆子，香蕉，土豆） ，过 4.5mm 筛。用 AOAC 法 925.10（15 ） ，测定干样中

11、的含水量，根据 AOAC 法 925.10，冻干后烘炉干燥测定鲜样中的含水量。分析方法（a）水解和溶液化非抗性淀粉1.准确称取 100mg（5 mg）样品后直接倒入有螺旋帽的试管里，轻柔的拍打试管以保证样品集中在底部。注意：对于湿样，样品大概为 0.5g(准确称重)，这些材料的含水量通常为 60-80%。2.每个试管中加入 4.0 mL-胰淀粉酶（10 mg/mL）其中含有 AMG（3 U/mL） （溶液2）3.盖紧试管盖子，用涡旋振荡器混匀，卧式放入振荡水浴器，与运动方向平行。如下图所示：4.连续振荡，37孵育，精确孵育时间为 16 小时。 （备注：200 里程/min）5.把试管从水浴锅中

12、拿出，用纸巾擦掉多余的水。拿开盖子，加入 4.0mL 乙醇（99% v/v）或者 IMS（99% v/v） ，用涡旋器涡旋。6.1500g 离心，10 分钟（不加盖）7.小心倒出上清，加入 2mL 50%乙醇或 50% IMS 重悬浮，用涡旋器涡旋，再加入 6mL 50%IMS，混合，1500g 离心， 10 分钟8.小心倒出上清，重复上述重悬浮和离心步骤。9.小心倒出上清，翻转试管，用纸巾吸除多余的液体。（b）测定抗性淀粉含量1.将试管冰浴，再向每个试管中加入磁力搅拌棒和 2 mL2M 的 KOH，用磁力搅拌机在冰浴/ 水浴状态下搅拌 20min，以重悬浮絮状物和溶解 RS。如下图所示：备注

13、：（1 ）不要使用涡旋器混匀，那将会导致淀粉乳化。（2 ）确保边加入 KOH 溶液边剧烈搅拌试管里的样品。这将会避免形成难溶的淀粉块。2.向每个试管中加入 8 mL1.2M 的醋酸钠缓冲液（pH3.8） ，并用磁力搅拌机搅拌。立即加入 0.1mLAMG（溶液 1；3300U/mL）,混匀，并放入 50水浴。3.孵育 30min,期间用涡旋器间歇混匀。4.对于 RS 含量10%的样品，用水洗瓶定量转移试管里的样品至 100mL 容量瓶，当用洗瓶洗涤试管中的溶液时用外磁铁保持试管中的磁力棒。用蒸馏水定容至 100mL，并混匀。以单位体积离心溶液，1500g，10min。5.对于 RS 含量10%R

14、S）=EF100/0.11/1000100/W162/180=EF/W90抗性淀粉（g/100g 样品） （样品包含10%RS）=EF10.3/0.11/1000100/W162/180=EF/W9.27非抗性淀粉含量（g/100g 样品）=EF100/0.11/1000100/W162/180=EF/W90总淀粉含量=抗性淀粉含量+非抗性淀粉含量E=相对于空白试剂的吸光度值F=从吸光度值到微克的转换（在 GOPOD 反应中 100gD-葡萄糖的吸光度值是确定的，F=100（D-葡萄糖的 g 数）除以这 100gD-葡萄糖的 GOPOD 吸光度值）100/0.1=体积校正（从 100mL 取

15、0.1mL）1/1000=从微克到毫克W=分析样本的干重=重量 （100-含水量）/100100/ W=RS 在样品重量中百分比因子162/180=从测定获得的游离 D-葡萄糖转换到淀粉中存在的脱水-D-葡萄糖的因子10.3/0.1=体积校正（从 10.3 mL 取 0.1mL） ，对于含有 0-10%RS，当孵育溶液时没有被稀释，最终体积为-10.3 mL。当分析湿样时，体积会增大，在计算时应计算折扣。表 1.使用试管内分析方法获得的 RS 值与活体结果的比较RS(试管内分析方法 /结果) a RS(活体)淀粉来源Englyst Faisant Champ McCleary Gonib马铃薯淀粉（土著）66.5 83.0 77.7 77.0 - 78.3高直链淀粉玉米淀粉（土著）71.4 72.2 52.8 51.7 - 50.3高直链淀粉玉米淀粉（退化）30.5 36.4 29.6 42.0 37.8b 30.1豆片 10.6 12.4 11.2 14.3 15.3c 9-10.9玉米片 3.9 4.9 4.3 4.0 4.7c 3.1-5.0罐装豆子 17.1 - 17.1 16.5 - 16.5ActiStard 63d - 57d 58.0 57d 54d