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1、,第十三章 遗传病的诊断Diagnosis of Genetic Disease概述 临床常规诊断 遗传学检测 现症患者诊断 症状前诊断 产前诊断,第一节 现症患者诊断 一、临床常规诊断 （一）采集病史家史：亲缘、婚姻关系 发病况 绘系谱 婚史:婚龄 次数 配偶况 近婚生育史：育龄 子女数 流、死产史 产伤 病毒感染（二）症状与体征1.智力低下2.特殊面容,3.特殊气味4.耳聋5.肝脾肿大 糖原贮积病 半乳糖血症 粘 多糖病 6.皮肤毛发异常7.肢体畸形 高 高大 矮 手足8.生殖器变化 ？9.生长发育迟缓（三）实验室检查和辅助检查,二 、 系谱分析(pedigree analysis)（一）

2、系谱分析步骤：1.了解成员发病况2.绘制系谱 讲方法3.判断遗传方式、基因型4.估计发病率5.处理意见注意： 准确 完整 详细,（二）孟德尔遗传病1.AD、AR、XD、XR、YL2.注意事项 1） 外显不全、隔代2）延迟显性 3）新突变 4）遗传异质性 （多种遗传方式）例：先天性聋哑 AR、AD、XR、环境 特发 先天性白内障 CS畸变 AD、AR、胎内感染 特发,（三）非孟德尔遗传病1.mt遗传病 母系遗传 遗传瓶颈 晚发、进行性2.多基因病 发病率比单基因病低（四）基因组印记与动态突变（略）,三 、细胞遗传学(cytogenetics)检查（一）CS检查1.CS检查指征：1）智力低，生长发

3、育迟缓，先天畸形；2）夫妇之一有染色体异常；3）家族中已有CS病患者；4）多发性流产妇女及其丈夫； 5）原发闭经和女性不育；无精子症和男性不育； 6） 35岁以上高龄孕妇 。,7）两性畸形者 8）身材高大，性情粗暴男性 9）恶性血液病患者10）长期接受X线、电离辐射人员11）疑为先天愚型者；疑为脆性X综合征者。2.CS显带分析（前述）（二）性染色质检查：性染色体数目异常。不分裂细胞：X染色体数=X染色质数+1 Y染色体数=Y染色质数,（三）荧光原位杂交（前述）（fluorescence in situ hybridization,FISH)用生物素或荧光素标记探针 制备被测标本 变性 分子杂交

4、 荧光显微镜检测例1：21号CS着丝粒探针,例1,例2,四、生物化学检查（一）酶和蛋白质的分析-确定单基因病 参表 利用血液和特定的组织，细胞对酶的活性和蛋白质的含量进行检测。主要方法有：电泳技术，酶活性检测，层析技术，免疫技术，氨基酸顺序分析技术等。（二）代谢产物的检测-反映酶活性 利用血液、尿液和羊水对代谢产物进行质和量的检测。主要方法有：血液滤纸片法，显色反应。,五、 基因诊断 gene diagnosis 采用分子生物学方法在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。 可基因诊断的疾病约1000种？,（一）基因诊断的基本技术 *包括： 分子杂交技术；聚合酶链式

5、反应(PCR)技术 * DNA序列测定技术； 基因芯片技术,1.分子杂交技术 （molecular hybridization）1）原理：变性成单链复性成双链（分子杂交）基因诊断2）过程：制备探针并标记分离靶DNA变性处理-探针与靶DNA杂交DNA或基因检测3）概念：基因探针（Probe）：是一段带有标记的，与待测基因有关的核酸序列。探针种类: 基因组探针（genomic probe） cDNA探针（cDNA probe） 寡核苷酸探针（oligonucleotide probe）,4）基因诊断方法（1）斑点杂交法 又称等位基因特异的寡核苷酸(ASO)探针杂交。 用人工合成的20个碱基左右长度

6、的ASO探针，一般要合成两种探针：正常探针，突变探针。 将待测的细胞或DNA直接点在硝酸纤维膜或尼龙膜上，将标记有同位素（或其他标记）的变性探针与其进行杂交，通过放射自显影，判断受检基因的有无以及基因的拷贝数，进行基因诊断。,ASO斑点杂交,1986年，胡流清等基于点突变原理，用寡核苷酸探针进行基因诊断。,（2）Southern 印迹杂交(略）（ Southern blotting hybridization) 是经分子杂交检测DNA或基因突变的技术过程：切割电泳变性转移80度烘烤固定杂交放射自显影观察。（参下图）,（3）northern印迹杂交（northern bloting)是RNA杂交

7、的常用方法。原理：应用特异性基因探针分析基因的转录，转录量的变异，mRNA的大小。过程:提取总RNA p193(4)western印迹杂交(western bloting)是在蛋白质水平检测或研究基因表达与功能的方法。过程:提取蛋白质p194(5)原位杂交（前述）,2.聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR） 聚合酶链反应技术是在体外迅速的选择性扩增特定的靶DNA的方法。PCR的原理：（1）合成引物：按靶DNA片段的5和3端的碱基顺序各合成两条引物（长约20个碱基的寡核苷酸）；（2）建立反应体系：将待测DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP），引物和耐热D

8、NA聚合酶（Taq 酶）；,（3）反应液进行热循环：每一周期经过变性（92-95），复性（40-60）和延伸（65-72）三个阶段产生倍增的DNA。一般进行20-40个周期。,PCR相关技术及应用：（1） PCR-ASO ：PCR/等位基因特异性寡核苷酸探针杂交PCR扩增 用ASO探针杂交 （2）PCR-RFLP：PCR-限制性片段长度多态性连锁分析PCR扩增 限制酶酶切 电泳（3）RT-PCR：反转录PCR 反转录酶 合成cDNA（4）多重PCR：用两对以上引物 （5）PCR-SSCP：PCR-单链构象多态性分析在突变点附近设计引物PCR扩增突变DNA构象变化电泳分离DNA测序 （6）PCR

9、-DGGE （7）定量PCR,PCR-SSCP,1989年，Orita等建立的PCR产物单链DNA凝胶电泳技术。,1：正常人 2,4,5：纯合体患者 3：杂合体(2的弟弟)左为泳动变位模式：a 正常人；b 纯合体患者,PCR-SSCP,3.DNA测序技术(DNA sequenceing Maxan和Gilbert首先建立了化学方法，Sanger建立了DNA测序的酶学方法。DNA自动测序法：以不同荧光色素标记的四种不同脱氧核苷酸为原料进行酶促合成反应，经过凝胶电泳分离，应用激光分析及计算机处理就能直接读出碱基顺序。而且测序的长度可以达到1000bp以上。,DNA测序（DNA Sequencing

10、)是检测未知突变和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。,4.基因芯片技术 （gene chip)基本原理：核酸杂交基本过程：将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比较和检测，得出所要的信息。,特点：是一种高效、准确的DNA序列分析技术，可同时对千余种基因的表达水平、突变、多态性进行检测。例：地贫检测,（二）基因诊断的途经和方法(略）1.途径1)直接诊断 检测突变基因 直接诊断是直接检测致

11、病突变的基因。它通常使用基因本身或紧邻的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，以探查基因有无突变、缺失等异常及其性质，这称为直接基因诊断，它适用已知基因异常的疾病。 当致病基因的某种突变类型与发病有直接的因果关系,或者对致病基因以及分子机制已完全了解,或者对致病基因以及分子机制部分了解但已知其中规律,可应用此途径。,2) 间接诊断 基因连锁分析 当致病基因虽然已知但其异常尚属未知或突变类型较多时；或致病基因本身尚属未知时，但被检测基因有紧密连锁的DNA多态标记，可以通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。 连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性

12、位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。RFLP、VNTR、SSCP、AMPFLP等技术均可用于连锁分析。,2.基因诊断的方法选择： 各种遗传病的基因异常是不同的，同一遗传病也可以有不同的基因异常，但这些异常大体可分为基因缺失和突变两大类型。根据对基因异常类型的了解，可以采用不同的诊断方法。,遗传的基因诊断方法基因异常 方法 探针、引物或限制酶基因缺失 基因组DNA印迹杂交PCR扩增 缺失基因的探针 引物包括缺失或在缺失部位内点突变 RFLP分析ASO杂交 突变导致其切点消失的限制酶 PCR产物的多态性分析 正常和异常的ASO探针 （RFLP、SSCP、DGGE） 引物包括突变部位基

13、因已知 基因内或旁侧序列多态性 基因内或旁但异常不明 （RFLP、 SSCP、AMPFLP） 侧序列探针或引物 连锁分析 基因未知 与疾病连锁的多态性， 与疾病连锁的多态 如SSCP、AMPFLP连锁分析， 位点探针或引物 RFLP位点单体型连锁分析,（三）基因诊断在遗传病诊断中的应用1 对单基因病的基因诊断（1）点突变型遗传病的基因诊断,镰形细胞性贫血的基因诊断ASO探针诊断法：,RFLP诊断法：RFLP(restriction fragment length polymorphism): 不同人的DNA用同一种限制酶切割，可切出不同长度的片段。例：Hbs病6 GAG（谷）GTG（缬）Mst

14、可识别并切割A:CCTGAGG序列 不能切割s: CCTGTGG序列 此切点消失,IVS-,1.15kb,Mst切点,1.15kb,0.2kb,HbA,1.35kb,AT HbS,1.15kb,1.35kb,0.2kb,正常,杂和体,HbS病,失,无过氧化氢酶血症（acatalasemia) （略） 是一种常染色体隐性遗传病，患者过氧化氢酶活性只有正常人的0.2%0.4%，杂合体血液中过氧化氢酶活性则处于中间水平。过氧化氢酶基因由13个外显子和12个内含子组成。应用32P标记PCR反应中底物方法，扩增第4个外显子和内含子附近的203bp片段，应用SSCP法可清楚地判断患者和杂合体。,aa/aa

15、 aa/- aa/a- a-/- -/-,14kb10kb,10kb 4kb,BamH I,BamH I,左侧：16号染色体上携有数目不同的基因右侧：a基因探针杂交的结果, -地贫基因缺失的诊断,正常,贫血症状,携带者,HbH,（2）基因缺失型遗传病的诊断,RFLp诊断（略）：,PCR诊断：（polymerase chain reaction ,)PCR原理（参下页举例）,950C 560C 720C,变性 退火 延伸,例：诊断Barts胎儿水肿综合征。1）建立反应体系 2）DNA扩增3）电泳检测,待测DNA,基因引物,dTNP,Taq酶,950C 560C 720C,变性 退火 延伸,基因,

16、DMDBMD的缺失型诊断：,（3）基因异常不明的遗传病的诊断 以苯丙酮尿症( PKU )的基因诊断为例。RFLP分析： p202上,一个PKU家系的RFLP单体型分析 （略）,（略）,单体型分析,（略）,ASO Hybridization法：,PKU家系PAH基因STR连锁分析（略）,2多基因遗传病的基因诊断（略） 人类基因组多态性是多基因病基因诊断的基础，易感基因多态性的检测能帮助我们理解多基因病发生的机制，有助于对疾病的诊断和分类。 目前已经发现一些多基因病相关基因，如载脂蛋白E基因（ApoE）的多态性与阿尔茨海默病（AD）有高度相关性，血管紧张肽转换酶基因的多态性与原发性高血压和心肌梗死

17、高度相关。,3 对肿瘤的基因诊断ras基因突变的检测 ras基因突变的检测可采用PCR-ASO方法进行，已知ras基因突变的热点在12、13及61密码子。 p53基因的检测 目前常用PCR法进行检测p53突变的热点是外显子5-8，一般可先选用外显子5-8的引物进行扩增，其后再进行突变位点的详尽分析，甚至测序。另一初步检测p53基因突变的方法为PCR-SSCP，然后测序。,（五）疾病基因诊断的展望未来的基因诊断主要发展方向 *胚胎着床前诊断在囊胚8个细胞期，通过对其中一个细胞的染色体核型分折和原位杂交，从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段； *母体外周血中胎儿细胞分析技术； *对常见病、多发病如

18、心血管系统疾病、糖尿病、精神疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤、哮喘、近视眼等进行分子诊断。,第二节 症状前诊断（pre-symptomatic diagnosis） 指在遗传病的临床症状出现前所作的诊断。 是针对一些发病年龄延迟遗传病 (AD、AR、XR等) 的诊断方法。这些个体往往早期表型正常，延迟发病，如果能在出现症状之前作出诊断，可以早期治疗，并避免将致病基因传递给后代，减少遗传病的发病率。,症状前诊断方法有4种：1家系分析法和风险估计 2生化学检查3基因分析 4. 新生儿筛查（neonatal screening）是对已出生的新生儿进行某些遗传病的诊断，是出生后预防和治疗某些遗传病的有效方

19、法。,第三节 产前诊断（prenatal diagnosis)定义：产前诊断即宫内诊断 生前 遗传病畸形、性别一 、产前诊断的对象 1.夫妇之一有CS畸变。2.35岁以上高龄孕妇。3.夫妇之一有神经管畸形或生过畸形儿。4.夫妇之一有先天代谢缺陷或生过该病患儿。5.有原因不明的习惯性流产、死胎、死产及新生儿死亡的孕妇。,7.羊水过多。8.夫妇之一有致畸因素接触史。9.有遗传病家族史、近婚的孕妇。二 、产前诊断的方法1、X线：24周后 骨骼畸形。2、超声波：无痛、无损伤。3、胎儿镜：18-20周 直接观察 取材4、羊膜穿刺术（amniocentesis)：16-18周 取标本（参下图）5、绒毛吸取

20、术(chorionic villus sampling)：7-9周,非侵袭性,经腹壁羊膜腔穿刺,经腹壁取绒毛样品,经阴道、子宫颈进入子宫绒毛样品,6、脐带穿刺术：约18周。胎血取样。7、孕妇外周血分离胎儿有核红细胞：前景 胎儿游离DNA 无创性8、母体血清三项筛查： Down综合征：AFPuE3HCG9、实验室检查 染色体 生化 基因 10、植入前诊断（preimplantation genetic diagnosis,PGD) ：植入前体外受精、培养、检测。 过程：体外受精、培养8细胞时胚胎组织微活检染色体、基因检测据结果决定是否培养与移植。 前景,第四节 皮肤纹理分析(略）概述皮纹手指、掌

21、面、足趾、（足/庶）面的嵴纹和沟纹走向的不同形成的皮肤纹理。人胚1213周 一卵双生 0.953 多基因遗传 终生性辅助诊断手段（一）正常皮纹1.指纹 指端部的皮纹1）弓形纹（arch,A)特点：嵴纹由一侧走向另一侧,2）箕形纹（loop,L)特点：嵴纹从一侧发出，折回原侧，有一三叉点尺侧 桡侧3）斗形纹(whorl,W)特点：两个三叉点图 环形斗 螺形斗 绞形斗,4)总指嵴纹数Total finger ridge count,TFRC)十指嵴纹总数2.掌纹1）指间花纹2）大、小鱼际花纹3）主线式A 、B 、C 、D主线A小鱼际4）t三叉与atd角正常人 1.4cm 410 掌纹图,3.手掌褶

22、与指褶（1）手掌褶（图）1）正常2）通贯手（远近合一）正常人4%3）变异型4）变异型5）悉尼手（2）指褶小指有意义,4.拇趾球部皮纹7形：斗、远侧箕、腓箕、胫箕、近弓、腓弓、胫弓（二）皮纹检查方法（三）CS病患者皮纹特点1. Town syndrome (唐氏综合征)1）atd600 (82%)2) 胫弓（72%） 3）通贯手（31%）4）小指只一指褶（17%）5）箕、弓、TFRC,胫弓,2.18三体综合征（1）弓纹（80% 7）（2）小指1指褶（40%）（3）通贯手（25%）（4）atd700 （25%） 3.13三体综合征 （1）弓纹（2）双通贯手（62%）（ 3） atd700 （81%）4.Turner syndrome : atd大，斗5.Klinefelter syndrome :弓纹 总结：多种CS病共有皮纹特点atd大，通贯手，弓纹，球部胫弓。,