高效液相色谱中异常峰分析.doc

1、 异常峰分析 异常的色谱峰指的是色谱图中的无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。异常峰是色谱实验工作中最棘手的问题。这些峰严重影响色谱分析的结果。色谱图中不可能有纯正的高斯对称峰 , 轻微的拖尾是正常的 , 这是由分离系统所决定的。在此仅对几种异常峰进行分析。 1.峰前或峰后有小峰的分析 产生原因大致分为以下几种情形 (1) 样品不纯。可改变不同的流动相和色谱柱 ,对样品进行分离比较 , 选择合适的分离条件。 (2) 分析柱或保护柱柱头塌陷。此情况较常见 ,可更换分析柱或保护柱后对峰形进行比较。柱头塌陷时往往所有的峰都会出现峰分裂 。对色谱柱再生和清洗可以改善分离效果。 (3)

2、色谱柱柱容量下降。当长时间使用后 , 有一些强保留组分吸附在柱子中 , 不大的进样量往往就会出现峰分裂。用强洗脱能力的溶剂清洗色谱柱 , 或更换色谱柱可使问题得到改善。 (4) 样品溶剂与流动相不匹配或进样体积过大。当样品溶剂比流动相极性大时 , 有时即使进样体积很小 , 也容易出现峰变形和裂分现象。建议用流动相溶解样品。 (5) 流动相不恰当。此情况较罕见 , 有些样品在特定的色谱条件下可能存在结构的动态平衡 , 而出双峰 , 这种双峰是无法分离完全的 , 改变色谱条件尤其是 p H 值会使峰形正常。 (6) 样品分解。不稳定的样品在色谱分离过程中变成其他物质而出现双峰。这时需改变样品处理方

3、法或色谱分离条件。 2.负峰分析 在色谱分析中有时会出现负峰或倒峰 , 如图 3 中的大峰的左下就有一负峰。出现这种现象可能是由以下几种原因引起的 , 可针 对不同情况进行排除 , 进而使问题得到解决。 (1) 流动相吸收本底值过高。此时可适当改变检测波长。 (2) 进样过程中进入空气。进行排气处理 , 直到基线平稳再进样。 (3) 样品组分的吸收低于流动相。可改变流动相或改变检测波长。 (4) 配制样品的溶液与流动相不一样。重新配制样品 , 用与流动相一样的溶剂配制或稀释样品。 3.前沿、拖尾峰分析 拖尾： 1 干扰峰，优化条件分离 ； 2 色谱柱塌陷，更换色谱柱； 3 流动相 pH不合适，

4、调节 pH 值 ； 4 管路没有接好，存在较大的死体积，可以重新接一下。 前沿： 1 溶剂选择不合适，选择合适的溶剂 ； 2 样品过载，降低进样量； 3 柱温太低，升高柱温 ； 4 色谱柱损坏，更换色谱柱 ； 图谱前沿和拖尾的原因主要是流动相选择不合适，可以相应调整流动相的极性，或者适当加入酸来调整，可以得到较好的改善。一般来讲，酸碱在流动相中对于前沿和拖尾影响较大。 柱前沿是可能因为柱超载，拖尾是可能因为样品被污染，选择合适的流动相，调节好 PH 能够改善这以情况。 前辈们总是会告诉我们，拖尾峰与柱子有关，可能是过载，稀释样品再做，或换新柱做。 有时候托尾峰往往是有机性相近杂质没有分开，此时

5、， 可以优化分析方法，或更换柱子试一试；也可能由于柱子使用时间太久柱效下降出现塌陷等原因；再有也会根样品本身性质有关，基团需要流动相中添加能与之结合优化峰形的化学物质，要根据具体情况而定。 4.色谱双峰产生的可能及判断和处理 液相上有一句经典的话说得好 “出两个峰肯定不是一种物质，出一个峰不一定是一种物质”。 而色谱双峰指的是明是一种物质，但在色谱图中出现双峰，而表明含二种物质。我将这种情况分为四种原因。 1） 色谱柱 如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现（出峰越快，双峰的可能性会减少），尤其采用单一纯物质时，可以肯定色谱柱出问题柱头受损或柱头固定相变脏或流失。如果进样量少，原来色谱柱正常

6、，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，高频红外碳硫分析仪这是可以将进样那头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填 料，重新填上新填料拧紧，不过这种活，需要一定技术，同时不能老干那种事，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效很低而报废。 2） 溶剂极性及进样量 许多 HPLC 分析者对此可能不以为然，一般的 HPLC 的书籍和文献都不会提到这方面的内容，而这确是双峰产生的一个很重要的

7、原因。目前 HPLC 分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解方法是用流动相溶解，但是很多情况是不一致的。当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主，样 品进样量大，如定量管为 20ul，此条件下完全可以肯定，单一的纯物质出双峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一样），且拖尾，保留时间会提前（相对进样量少而言），将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。上面提到进样量造成双峰的一个原因，另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量

8、很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色谱柱问题）。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。 3） 样品的特性 有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时，在一个特定的条件下，一种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其 pH，双峰现象将消失，如红霉素等。有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在 LCMS 下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显，例如我分析过的农药啶虫眯（吡虫清）。 4） 参数 记录的参数一般都内定的，不必修改，但 GC

9、和 HPLC 的参数是不完全一致的，例如 C R3A 数据记录仪上的一般记录时间间隔 GC 为 2ms， HPLC 为 5ms，如果记录间隔时间缩短，一个峰将变为二个峰或更多。 5.鬼峰、倒峰、未出峰 6.峰裂分 裂峰产生原因的确定 样品基质复杂或分析多种样品 柱污染或部分阻塞滤片 流动相 pH=7 由于硅胶溶解导致柱塌陷 (除非使用专门的柱子 ) 溶剂比流动相的强度大 可能产生裂峰或宽峰，由样品量决定 （溶剂化效应） 7.峰拖尾、峰展宽、峰前伸 峰拖尾原因的确定 评价柱选择 使用高纯度硅胶柱或不同键合技术柱 评价流动相效果 改变流动相 pH 和添加剂消除次级效应 (流动相中组份与柱子相互作用

10、 ) 减小进样量 消除柱外效应 冲洗柱子 检查柱子老化 /塌陷 易记小卡片来了：其它常见峰异常问题汇总 Q&A 峰问答 进行 HPLC 分析时，怎样才能知道某一个色谱峰是否是单一峰呢？特别是分析中药成分的时候？标准品加入法、 DAD、还有改变流动相的组成是否能说明呢？ 1、多种不同原理的方法比较是首选。 2、其次采用 DAD 检测器进行光谱分析，如果提示不纯，估计有问题。纯度阈值受仪器、流动相等影响，所以只能作为参考。对于分子结构中差异有紫外吸收官能团的， dad 检测器一般还是可以准确判断峰纯度的，但对于结构中无紫外吸收的那些差异， DAD 检测器就无能为力了，比如某肽链中的氨基酸差异、或者一些对应异构体， dad 也是无能为力的。 3、如果 DAD 不行，那么就需要采用质谱鉴别了，优选液质联用，如果是含盐流动相，可以采用收集不同时段的色谱流出物的方式，脱盐，进行质谱检测。 4、如果怀疑有异构体，这个就比较头疼了，非对应异构体需要二级（主要是对CID 的能量有要求，可以打断侧链）的质谱才能判断侧链的区别。对应异构体的辨别目前好像只有 waters 的离子淌度质谱（没做过）有一定的分辨 能力，但也不是万能的。 所以峰纯度判定需要结合化合物及可能杂质的结构特点，来合理选择。