心血管药理学的研究方法.ppt

1、 心血管系统的结构 1、心脏 2、血管 (1) 动脉 主动脉 外周动脉 (2) 静脉, 高脂血症的研究, 动脉粥样硬化的研究, 血管再狭窄的研究, 高脂血症的研究,血脂异常是血中总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）超过正常范围及（或）高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）低下。 高脂血症是指TC或（和）LDL-C或（和）TG增高。血脂异常在动脉粥样硬化（AS）的发生发展及其引起的心血管事件（CVE）中起非常重要的作用。,高TC血症，特别是LDL-C增高，是发生CHD的最重要的危险因素。 流行病学资料显示，芬兰TC最高，CHD发病率也最高，日本TC最低，CHD发病率也最

2、低。,高脂血症患者的开始治疗标准值及治疗目标值,降脂中药筛选及药理学研究, 体外模型, 体内模型,体外筛选细胞模型(研究阶段),肝细胞,卵细胞,胆固醇,甘油三脂,脂酰CoA转移酶,羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶,脂酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT),Y,?,体内筛选动物模型(用于降脂药物筛选及机制研究), 家兔, 大鼠, 小鼠, 金黄地鼠,家 兔, 常用日本大耳兔或新西兰白兔。 兔是喂饲富含高胆固醇食物引起高脂血症和动脉粥样硬化病变的敏感动物。 通过调整饲料可制作内源性高脂血症和外源性高脂血症模型。 造模后形成的主动脉斑块及冠状动脉粥样硬化病变与人类相似。, 灌胃给药操作不便，

3、灌胃不当易造成死亡。 高脂血症模型及动脉粥样硬化斑块形成时间较长，耗费饲料，动物成本较高。 血清中VLDL占总胆固醇的比例过高，且兔为草食动物，其脂代谢与人差异较大。 因无较为理想的高脂血症动物模型，目前有关调脂新药和抗动脉粥样硬化药物的研究中，家兔仍然是一种常用的实验动物。,家兔高脂血症造模,大鼠是目前国内研究人类脂质代谢使用最多的实验动物。选用SD大鼠或Wister大鼠造模。 易于饲养管理，抵抗力较强 给药容易 采样方便，血量丰富，便于一次较多指标的检测 在国外高脂血症研究中，大鼠的使用逐渐减少。 a. 大鼠血清中高密度脂蛋白(HDL)是血浆胆固醇的主要载体。 b. 对抗动脉粥样硬化形成的

4、能力,大 鼠, 用高脂饲料喂养大鼠，一般7-10天可形成高脂血症模型。 影响因素： a. 饲料中掺人了胆固醇、猪油等油腻的高脂物品，使饲料性质发生改变，有异昧，动物易出现“厌食”；而且不易于掌握精确的饲料用量。 b. 进口胆酸纳价格昂贵。 c. 高脂乳剂黏稠，不易抽取，灌胃造模时，用量不易准确控制。 d. 所造模型大多为外源性胆固醇摄入过量所致。,大鼠高脂血症造模,小鼠在调血脂药临床前研究中应用越来越多。 价格便宜，造模成本低，采样较方便。高脂饲料喂养可成功建立高脂血症模型。基因缺损和基因敲除小鼠已成功地用于药理学研究中。 具有清楚的遗传背景，繁殖力强，模型稳定。 血脂水平与人类接近，主动脉和

5、冠状动脉均有明显的斑块形成，可用于动脉粥样硬化的实验研究。 apoE基因缺损小鼠及LDL基因敲除小鼠血脂升高不受人为因素影响。,小 鼠, 急性高脂蛋白血症的可用一种表面活化剂(Triton WR-1 339)给小鼠尾静脉注射，1224 h即可诱导出高脂蛋白血症模型 ，可用作初筛新药。 正常小鼠用高脂饲料喂养造模时间长。 采血量少，指标的检测受限。,小鼠高脂血症造模, 普通饲料喂养时，成年鼠血清胆固醇水平是正常鼠的58 倍。 当给予高脂负荷饲料(20 %脂肪，0.3 %胆固醇后) ，血清中胆固醇浓度可达普通饲料喂养升高值的45 倍。 血脂升高稳定。 遗传背景为C57BL/6品系。 繁殖能力较强。

6、,apoE-/-小鼠, 行动灵敏，易发生逃逸。 性情较其他品系小鼠急，抓持不当易被咬伤。 成年雄鼠之间易发生撕咬。,apoE-/-小鼠, 较好地反映人类胆固醇代谢的调节。如肝脏合成胆固醇的比例，人内源性胆固醇约有90%是肝外组织合成的，雄性金黄地鼠肝外合成比例约为85%，而雌性大鼠只有35%是肝外合成、雌性小鼠只有55%在肝外合成。 较低的高脂负荷即可建立理想的动物模型。饲料中胆固醇含为0.2%即可成功造模。大鼠饲料中胆固醇的含量多为1-2%，超过自身合成量的10倍， 且要在饲料中加入胆汁酸盐才有能达到理想的血脂水平。 建立高脂血症模型所需时间短。喂饲高脂饲料后3-4周，血TC、TG 可达较为

7、稳定的水平。,金黄地鼠(hamster),降脂中药的药理学研究(一), 脂质含量及酶的测定 a. 血脂含量的测定 血清总胆固醇(TC) 血清甘油三酯(TG) 血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) b. 血清酶活性测定 羟甲基戊二酰CoA(HGM-CoA)还原酶 肝脂酶(HL) 脂蛋白脂酶(LPL) 卵磷脂胆固醇酯酰转移酶（LCAT）, 载脂蛋白含量的测定 apoAI apoB apoC LDLR活性测定 放射性配基法 酶联免疫吸附法 激光共聚焦显微镜测定法 LDLR基因表达,降脂中药的药理学研究(二), 动脉粥样硬化的研究,与动脉粥样硬化形成有关的细胞和分

8、子,Fatty-Streak Formation in Atherosclerosis,Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis,Unstable Fibrous Plaques in Atherosclerosis,Formation of an Advanced, Complicated Lesion of Atherosclerosis,ApoE Knockout Mice,0 6 12 18 wks of age,High Fat 0.3% CholesterolT-Chol 1500-1800 mg/dl,Normal ChowT-Chol

9、 500-700 mg/dl,Atherosclerotic Lesion,抗动脉硬化中药的药理学研究(一), 血脂的测定 病理形态学研究 制作主动脉弓病理切片 染色及斑块面积的测定，测定斑块面积用imagepro plus软件 分子病理学研究 通过免疫组织化学，用特定的抗体检测斑块组织中相关分子的表达,抗动脉硬化中药的药理学研究(二), 分子生物学研究 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)及其受体c-fms的基因表达 血小板来源的生长因子(PDGF)受体的基因表达 凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)的基因表达 趋化因子(cxcl16、MCP-1及其受体CCR2等), 血管再狭窄的研究,

10、动物模型,三种小鼠血管再狭窄模型 塑料微导管损伤模型（Cuff 植入模型） 金属丝颈动脉损伤模型 金属直弹簧丝股动脉损伤模型,塑料微导管损伤模型,金属丝颈动脉损伤模型,(据Lindner医师等所著论文的图例部分引用）,金属直弹簧丝股动脉损伤模型,（据Sada医师等所著论文引用）,C57BL/6Mice(Recipient),BM cells=5X105,Bone Marrow Transplantation,GFP+/LDLR -/- Mice(Donor),Irradiation (9Gy),Polyethylene Cuff,Sham Operation,Left Femoral Arte

11、ry,Right Femoral Artery,Mouse Vascular Injury Model,Cuff Placement,Cuff-placed Artery,Sham-operated Artery,Bone Marrow-derived GFP-positive Cells in C57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling Lesion,Anti-Macrophage BM8,Macrophage like Cells in C57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling Lesion,Cuff-placed Artery,Sham-

12、operated Artery,GFP,Merged,Bone Marrow-derived Smooth Muscle Cells in Cuffed Femoral Artery of C57Bl/6 Mice,Anti-a actin(2 weeks),SM1(2 weeks),Cy3,Anti-a actin(1 week),Cuff-placed Artery,Sham-operated Artery,CD31-positive Cells in C57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling Lesion,Bone Marrow-derived ECs in C

13、57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling Lesion,Anti - vWF,1 week,2 weeks,Anti-PDGFRbAnti-c-fmsControl IgG（1mg/day）,9,Cuff Placement Day 2,10,Cuff Placement and Administration of anti-c-fms and anti-PDGF-Rb mAb,C57Bl/6 (8 weeks of Age)on Normal ChowDiet,Sacrifice,8,Age (wk),Anti-PDGF-Rb treated,Staining of

14、Macrophage and Smooth Muscle cells in Mice Injected with anti-c-fms and anti-PDGF-Rb mAb,Anti-c-fms treated,Immunostained with BM8,Immunostained anti a-actin,Anti-Rat IgG treated,Distinct Cellular Hierarchy in Atherogenesis and Cuff-mediated Vascular Remodeling,Endothelial Cell,Smooth Muscle Cell,X,

15、X,Smooth Muscle Cell,Macrophage,Endothelial Cell,Atherogenesis,Cuff-mediated Lesion,Macrophage,Endothelial Cell,Macrophage,Smooth Muscle Cell,GFP,SMC,merged,Bone Marrow-derived Smooth Muscle Cells in Cuff-induced Vascular Remodeling Lesion,Scale Bars=100m,Cuff Placement(1 week),Cuff Placement(2 weeks),Bone Marrow-derived Endothelium Cells in Cuff-induced Vascular Remodeling Lesion,GFP,EC,merged,Scale Bars=100m,Cuff Placement(1 week),Cuff Placement(2 weeks),