NAC对坛紫菜高温胁迫下hsp70基因表达的影响【开题报告+文献综述+毕业设计】.Doc

1、本科毕业论文系列开题报告生物技术NAC对坛紫菜高温胁迫下HSP70基因表达的影响一、选题的背景与意义紫菜，英文名LAVER，是红藻门RHODOPHYTA原红藻纲PROTOFLORIDEOPHYCEAE红毛菜目BANGIALES红毛菜科BANGIACEAE紫菜属PORPHYRA的统称。紫菜营养价值高，是重要的食品、药物、工业化工原料的来源。广泛分布于世界各地，但以温带为主。自然生长的紫菜数量有限，产量主要来自人工养殖。坛紫菜PORPHYRAHAITANENSIS、条斑紫菜PYEZOENSIS和甘紫菜PTENERA是主要的养殖种类。近年来由于环境恶化而导致的全球海洋温度升高已经严重威胁着藻类养殖业

2、的健康发展。紫菜生活的特殊的环境使其有着独特的抗逆机制。深入了解紫菜的抗逆机理对全面紫菜健康养殖并进行紫菜抗逆品种培育有重要意义（杨锐等，2007）。另外，紫菜抗逆性的应用研究也有待深入，开发和研制适用于农业生产的高效自由基清除剂，以减轻活性氧在逆境胁迫中对紫菜的伤害而提高其抗逆性，有着广泛前景。环境胁迫能诱导植物抗逆蛋白热激蛋白、抗氧化酶等活性的变化，究其本质是逆境诱导植物抗逆基因表达变化的结果，检测不同环境胁迫导致不同的抗逆基因的表达有助于了解植物抗逆本质。MRNA水平上的定量检测是反映某个抗逆蛋白合成、调控的最直接可靠及灵敏的途径，不但可弥补传统酶活性测定精确度不高的缺陷，而且有助于准确

3、和全面了解其各种同工酶表达和发挥功能的差异。以往的研究中，检测基因表达水平的方法有NORTHERN杂交、RNASE保护分析、原位杂交等多种方法，但这些方法无法对MRNA进行精确定量，上世纪90年代中期诞生的实时荧光定量PCR（REALTIMEFLUORESCENCEQUANTITATIVEPCR）技术解决了这些问题，实现了MRNA从定性到定量的飞跃，使得从转录产物水平上精确研究基因的表达成为了可能。并且以其定量准确、检测范围宽（11011拷贝）、敏感度高（NAC组热激组，热激NAC组的表达量大约相当于热激组同一时间点的两倍。但是不同处理组HSP70基因的表达趋势较相似，均是逐渐上升而后急剧下降

4、（图18）。17无论是热激还是NAC处理下，HSP70基因的表达量均是逐渐上升（见图18），12小时到达顶峰，24小时也仍高于正常表达，可见坛紫菜HSP70基因功能的发挥不但具有“及时性”，而且具有“长时性”，即在整个处理过程中，HSP70基因会长时间的高量表达。原因可能和HSP70在细胞中行使的复杂功能有关。HSP70是典型的“分子伴侣”，多种新生蛋白质分子的定向移位及穿过亚细胞膜的过程都需要HSP70及其相关蛋白的参与。DESHAIES等人23认为定位于亚细胞器（内质网、线粒体等）的蛋白质，在细胞质中合成后需要改变构象，变成非折叠状，然后在HSP70的“陪伴”下才能穿过亚细胞膜，因此HSP

5、70起着“伸展酶”的作用，使新生蛋白质保持无活性状态，护送它们到达适当的位置。随着对HSP70生物学功能的深入研究，现已发现HSP70不仅可以结合ATP，而且具有ATPASE功能，还具有钙调蛋白结合位点，这在机体适应逆境的过程中具有重要的调节作用。5结论本课题利用实时荧光定量PCR技术研究了NAC对坛紫菜高温胁迫下HSP70基因表达的影响，发现无论是热胁迫还是NAC干预下，HSP70基因的应答反应不但具有“及时性”，短时间的胁迫就会导致其表达量迅速升高，而且具有“长时性”，即在整个处理过程中，HSP70基因会长时间的高量表达，这可能与HSP70在细胞内行使的复杂功能有关。5MMOL/LNAC可

6、能对坛紫菜耐高温胁迫并没有保护作用，对正常坛紫菜也有一定的毒害作用，而且这种毒害作用较热胁迫还要强烈，HSP70基因的大量表达是对这种胁迫的保护性应答，这可能与外源药物NAC破坏了正常细胞内的ROS稳态有关，但是，ROS是否作为这种应答的中间信号分子并不确定。这种伤害是否由高浓度的NAC引起或者低浓度的NAC是否能保护坛紫菜细胞免受ROS损害需要更进一步的研究。但也不排除其他假设，因为NAC的作用机理并不明确。参考文献1杨锐，张晓龙，徐丽宁等坛紫菜耐高温胁迫机理之初步研究EB/OLHTTP/EPUBCNKINET/GRID2008/DETAILASPXFILENAMEZGHI200708001

7、174DBNAMECPFD2007图18不同处理组HSP70基因的表达差异FIG18THEDIFFERENTEXPRESSIONOFTHEHSP70GENEINDIFFERENTGROUPS182MITTLERR,VANDERAUWERAS,GOLLERYM,ETALREACTIVEOXYGENGENENETWORKOFPLANTSJTRENDSINPLANTSCIENCE,2004,104904963HALLIWELLB,GUTTERIDGEJMCFREERADICALSINBIOLOGYANDMEDICINEM4RDEDITION,OXFORD,CLARENDONPRESS,20064AS

8、ADAKPRODUCTIONANDSCAVENGINGOFREACTIVEOXYGENSPECIESINCHLOROPLASTSANDTHEIRFUNCTIONSJPLANTPHYSIOLOGY,2006,1143913965MAHALINGAMR,FEDOROFFNSTRESSRESPONSE,CELLDEATHANDSIGNALLINGTHEMANYFACESOFREACTIVEOXYGENSPECIESJPHYSIOLOGIAPLANTARUM,2003,11956686XUSC,DINGHD,SANGJRREACTIVEOXYGENSPECIES,METABOLISM,ANDSIGNA

9、LTRANSDUCTIONINPLANTCELLSJACTABOTANICAYUNNANICA,2007,2933553657SACHINK,JANEL,UNGL,ETALCOMPLEXITYOFTHEHEATSTRESSRESPONSEINPLANTSJCURRENTOPINIONINPLANTBIOLOGY,2007,103103168于敏，李永春氧化应激对COPD大鼠膈肌影响N乙酰半胱氨酸的作用J广东医学，2010，31（19）224622489金鑫，吴河水，田元等N乙酰半胱氨酸对小鼠巨噬细胞TOLL样受体2/4基因表达的影响J中华肝病杂志，2006，14（11）85285410鲍红荣，

10、童立力N乙酰半胱氨酸的药理作用及其临床应用J浙江临床医学，2008，10（9）1274127511GUANL,SCANDALIOSJGTWOSTRUCTURALLYSIMILARMAIZECYTOSOLICSUPEROXIDEDISMUTASEGENES,SOD4ANDSOD4A,RESPONDDIFFERENTIALLYTOABSCISICACIDANDHIGHOSMOTICUMJPLANTPHYSIOL,199811721722412PFAFFLMWANEWMATHEMATICALMODELFORRELATIVEQUANTIFICATIONINREALTIMERTPCRJNUCLEICAC

11、IDSRESEARCH,2001292002200713KELD,CHENZ,YUNGWKARELIABILITYTESTOFSTANDARDBASEDQUANTITATIVEPCREXOGENOUSVSENDOGENOUSSTANDARDSJMOLCELLPROBES,2000,1412713514林钟婷，朱静，翁银标等热休克蛋白70的研究进展J中国畜牧兽医，2007，34（3）677015任宝波，王玉艳，王纯净等HSP70家族的分类及基因结构与功能J动物医学进展，2005，26（1）9810116SACHINKOTAK,JANELARKINDALE,UNGLEEETALCOMPLEXITY

12、OFTHEHEATSTRESSRESPONSEINPLANTSJCURRENTOPINIONINPLANTBIOLOGY,2007,1031031617BIERKENSJ,VANDEPERREW,MAESJEFFECTOFDIFFERENTENVIRONMENTALVARIABLESONTHESYNTHESISOFHSP70INRAPHIDOCELISSUBCAPITATAJCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGYPARTA120,1998293418IRELANDHE,HARDINGSJ,GRAHAMA,ETALEVALUATIONOFHEATSHOCKPRO

13、TEIN70ASABIOMARKEROFENVIRONMENTALSTRESSINFUCUSSERRATUSANDLEMNAMINORJBIOMARKERS,2004,9213915519KIMPELJA,NAGAORT,GOEKJIANV,ETALREGULATIONOFTHEHEATSHOCKRESPONSEINSOYBEANSEEDLINGSJPLANTPHYSIOL,1990,9498899520HARVEYBH,JOUBERTC,PREEZJL,ETALEFFECTOFCHRONICNACETYLCYSTEINEADMINISTRATIONONOXIDATIVESTATUSINTHE

14、PRESENCEANDABSENCEOFINDUCEDOXIDATIVESTRESSINRATSTRIATUMJNEUROCHEMRES,2008,3350851721郭志新N乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠肾脏NADPH氧化酶表达的影响J中国糖尿病杂志，2008，16（9）54454822朱超，苏冠方N乙酰半胱氨酸对GGO诱导HRPE细胞氧化损伤的保护作用J中国实验诊断学，2010，14（4）50851023DESHAIESRJ,KOCHBD,WERNERWASHBURNEM,ETALNATURE,1988,33280080519附录1紫菜叶状体总RNA的提取AXYPREP总RNA小量制备试剂盒1）

15、取适当量新鲜洁净的紫菜叶状体（75100MG），剪成小块，转移至预冷研钵中，加入液氮，快速充分研磨至粉末装（研磨时不断加入液氮，防止组织融化）；2）加入400LBUFFERRI，用装有18到23号针头的注射器反复抽吸810次，转入15ML离心管中。3）加入300LBUFFERRII，漩涡振荡1530SEC，12000G，4离心5MIN（4离心）。4）取上清至15ML离心管中，加入250L异丙醇，混合均匀。5）将制备管置于2ML离心管中，转移步骤4中的混合液移到制备管中，6000G离心1MIN（4离心）。6）弃滤液，将制备管置回到原来的2ML离心管中，加入500LBUFFERW1A，12000G

16、离心1MIN。7）弃滤液，将制备管置回到原来的2ML离心管中，加入700LBUFFERW2，12000G离心1MIN。以同样方法用700LBUFFERW2再洗涤一次。8）弃滤液，将制备管置回到原来的2ML离心管中，12000G离心1MIN。9）将DNA制备管置于另一洁净的15ML离心管中，在制备管膜中央加入4560LBUFFERTE或RNASEFREE水，10）室温静置1MIN，12000G离心1MIN，洗脱得RNA。附录2DH5大肠杆菌感受态的制备1）取取70保存的菌种划线接种于不含抗生素的LB固体培养基，培养过夜（12到16小时）2）挑取单菌落，接种于约4ML的LB液体培养基中，37摇床培

17、养过夜。3）过夜培养物（20ML）加入LB液体培养基（20ML）中，37（5000R/MIN）培养约2小时，至细菌浓度达到OD600为0305。4）无菌条件下迅速将培养物置于冰浴1530MIN，缓慢摇匀以保证培养物充分冷却至05）于44000RPM离心10分钟，收集菌体。6）倒出培养液，将管倒置1MIN，使残留液体流尽7）加10ML预冷的01MMOL/LCACL2溶液，重新悬浮沉淀混匀，冰浴30分钟（期间不断轻柔振荡混匀）；8）4000RPM离心10分钟，倒去上清（尽可能将所有的上清液去净），用2ML预冷的01MCACL2溶液重新悬浮菌体；9）按每管100L分装于预冷的灭菌EPPENDORF管

18、中（加入终浓度为20的无菌甘油），10）感受态细胞制备完成后在4冰箱中放置424小时内用于DNA转化。或者放入70或液氮中保存备用。附录3PCR产物的回收使用GENERAY试剂盒（上海捷瑞），按试剂盒操作指南回收特异PCR片段。具体操作步骤如下1）用干净锋利的手术刀片从琼脂糖胶中切下含有目的条带的凝胶块，放入15ML离心管；2）每100MG琼脂糖凝胶加入900LBINDINGSOLUTIONB，于5060温510MIN，每2MIN颠倒混匀一次，直至凝胶完全融化；203）将融化的凝胶转移至GENCLEANCOLUMN中，3000RPM室温离心1MIN；4）取出GENCLEANCOLUMN，并倒掉

19、收集管中废液，将GENCLEANCOLUMN重新放回收集管中，加入500LWASHSOLUTION，于8000RPM，室温离心30S；5）重复步骤（4）一至两次；6）再次弃废液，并于10000RPM，室温离心2MIN，以彻底去除WASHSOLUTION；7）将GENCLEANCOLUMN放入干净的15ML离心管中，加入15LELUTIONBUFFER在结合膜柱中央，37放置2MIN；8）10000RPM室温离心1MIN，离心管中的液体即为包含目的DNA片断的溶液，取25L进行电泳检测浓度，纯化好的DNA可立即用于后续实验或于20冻存。附录4PCR胶回收产物与克隆载体的连接和转化1）取少量胶回收

20、的PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳定量。2）在一个02ML的EP管中加入003PMOLPMD18T载体、0103PMOL纯化PCR产物，总体积控制在510L，再加入等体积的SOLUTIONI510L，混合均匀。3）16水浴中连接过夜，备用。4）把连接产物加入到感受态大肠杆菌中，冰浴30MIN。5）将离心管置于42水浴中保温90S，然后快速取出置于冰上56MIN；6）在离心管中加入200L的LB培养基；移至37，140RPM的恒温培养箱中振荡培养1H左右；涂平板，每个平板涂120L的菌液；7）37恒温培养箱中培养过夜，待菌落长出。附录5重组质粒的抽提1）使用35毫升菌液过夜培养，将菌液加入15ML离

21、心管，12000RPM离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升过夜菌沉淀。2）每管加入200微升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。3）每管加入400微升溶液II，轻轻颠倒离心管46次，使细菌完全裂解，溶液透明。4）每管加入700微升溶液III，随即颠倒离心管46次混匀，可见白色絮状物产生，室温放置2MIN。5）最高速12,000RPM左右室温离心5分钟。6）将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。静置2MIN，8000RPM离心60秒，弃流出液。保留收集管，将剩余液体加入纯化柱，8000RPM离心60秒。7）弃流出液，在质粒纯化柱内加入500微

22、升WASHSOLUTION，8000RPM离心60秒。8）弃流出液，重复上一步骤。9）弃流出液，放回收集管，10000RPM离心60秒，以除去残余WASHSOLUTION。10）将质粒纯化柱置于新的15毫升离心管上，加入50微升ELUTIONBUFFER至管内柱面上，放置1分钟。注ELUTIONBUFFER需要加至管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。室温放置2MIN，10000RPM离心2MIN。纯化后的质粒20保存备用。附录6阳性质粒的筛选和PCR鉴定挑取经AMP抗性筛选出的转化菌落进行小量液体培养，按照质粒快速提取试剂盒的操作说明书进行。PCR法对重组质粒进行鉴定21用灭菌牙签挑选单个阳性菌落，用20L灭菌超纯水溶解，作为PCR扩增模板备用。PCR扩增时，选外侧引物。PCR总反应体系为20L，反应成分包括质粒模板2L，上游引物05L，下游引物05L，10PCRBUFER2L，MGCL225MMOLL16L，DNTP10MMOLL04L，TAQDNA聚合酶02L，最后加超纯水至总体积20L。PCR反应条件94预变性3MIN，94变性30S，60复性30S，72延伸30S，共进行35个循环，最后于72延伸10MIN。PCR反应结束后，12的琼脂糖凝胶电泳检测产物。