曼氏无针乌贼过氧化物还原酶peroxiredoxin 1基因的克隆【开题报告+文献综述+毕业设计】.Doc

1、本科毕业论文系列开题报告生物工程曼氏无针乌贼PEROXIREDOXIN1基因的克隆一、选题的背景、意义和依据曼氏无针乌贼SEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNE（以下简称乌贼），俗称墨鱼，属软体动物门（MOLLUSCA）、头足纲（CEPHALOPODA）、二腮亚纲（DIBRANCHIA）、十腕目（DECAPODA）、乌贼超科（SEPIACEA）、乌贼科（SEPIIDAE）、无针乌贼属（SEPIELLA）1，是沿海广温广布种，广泛分布于我国渤海、黄海、东海、南海以及日本东京湾、富山湾以西、韩国、马来群岛、菲律宾群岛、苏联远东海和印度洋海域23。我国曼氏无针乌贼资源数量较大，曾是

2、浙江渔场四大渔业之一，作为主要经济鱼种被捕捞，浙江省历史最高年产量（1957年）达到67万吨4。但由于过度捕捞，资源遭到很大破坏，渔汛消失，80年代后期，特别是90年代以来，种质资源明显衰减，产量急剧下降，目前仅作为兼捕对象56。关于曼氏无针乌贼形态构造，生态生理78以及渔业资源10等方面的研究已有零星报道，80年代，唐逸民和李星颉等人1114进行了乌贼增殖及繁殖保护工作作了一些调查研究的工作。在繁殖方面，国外学者ROPERV等（1996）观察了BRACHIOTEUTHISBEANIIVERRILL的交配现象15，YOUNGRE等（1985）研究了BRACHIOTEUTHISBEANIIVER

3、RILL的卵与幼体，WATANABE1998研究了THYSANOTEUTHISRHOMBUS的胚胎发育，NIGMATULLINCM（1995）研究了THYSANOTEUTHISRHOMBUS的年龄、生长和繁殖生物学等16。乌贼墨汁储存于墨囊中，王春琳17等对曼氏无针乌贼墨囊进行了组织学及墨汁形成的超微结构，研究表明墨囊壁由外膜、肌肉层和黏膜三部分组成，墨腺体呈索状，集中于墨囊底部，墨汁颗粒以游离态形式分布于索状腺体的间隙及墨囊腔中。在具有分泌黑色素功能的B型细胞中可见黑色素颗粒储存在囊泡中，囊泡在移出细胞的过程中逐渐变大，泡内黑色素逐渐增多。囊泡可能通过胞吐的形式排出细胞外，黑色素排出后以颗粒

4、的形式游离于细胞间隙中，形成墨汁。有关乌贼的墨汁，具有凝血功能，作为一种中药被用于治疗多种妇科疾病，如功能性子宫出血、子宫痉挛和早起虚弱等病症。乌贼墨对非特异性免疫及特异性免疫功能均有影响。一方面能提高巨噬细胞活性,发挥非特异性免疫作用,抑制肿瘤生长另一方面,能作为免疫佐剂,促进抗体产生,提高特异性免疫功能,特别是体液免疫；在抗癌药物所致白细胞数低下时乌贼墨具有明显升白作用。乌贼墨汁的主要成分黑色素的生物合成的最后一步需要在过氧化物酶的催化下完成30。本实验室构建了曼氏无针乌贼墨囊CDNA文库，并对其中的一万条EST序列进行测序，发现一千多条UNIQUEGENE。通过序列比对，发现其中存在大量

5、表达的过氧化物酶家族中的PEROXIREDOXIN1蛋白基因。PEROXIREDOXIN1蛋白基因属于过氧化物酶家族，是过氧化物还原酶（PEROXIREDOXIN,PRX）的第六个亚型。PEROXIREDOXINS蛋白是新近发现的一类过氧化物酶，广泛存在于各类生物体中。第一个发现的PRXS家族蛋白来源于酵母中大小为25KD的蛋白质，最初命名为巯基特异性抗氧化酶18。哺乳动物的PRXS家族包括6个成员，即PRX，和。根据PRXS拥有一个或两个保守的半胱氨酸（CYSTEINE,CYS）残基，可进一步将其分为1CYS和2CYS两亚类。前者仅在52位上有一个高度保守的CYS,后者则在52位和172位上

6、分别有一个高度保守的CYS19。PRXI属于2CYS，。PEROXIREDOXINS家族中的6个成员在组织表达和细胞定位有所不同PRX和定位于细胞质中，在多种组织中表达；PRX定位于线粒体，实现立体特有的过氧化物酶；PRX具有分泌信号，在细胞外基质和内质网中可检测到；PRX存在于细胞质、过氧化物媒体和线粒体中；PRX存在于细胞质中。PEROXIREDOXINS蛋白家族基因所编码蛋白的生化功能是通过硫氧还蛋白还原过氧化物或超氧化物，在消除新陈代谢产生的过氧化物中具有重要作用。另外，该家族的个别成员还显示其他的活性参与细胞的增殖与分化2123；增强NK细胞的活性；保护自由基敏感蛋白；参与血红素的代

7、谢；参与某些细胞因子的信号转导24等。另外，PEROXIREDOXIN蛋白家族与肿瘤的关系密切25。该家族蛋白在多种肿瘤细胞中均具有较高表达，可能是肿瘤的一种潜在的标志物26。本课题拟对曼氏无针乌贼PEROXIREDOXIN1蛋白基因进行克隆和表达，为今后研究其跟黑色素形成之间的关系以及PEROXIREDOXIN1蛋白在曼氏无针乌贼抗氧化系统中的作用打下分子基础。二、有关研究的最新成果和动态大量的研究表明，PRX参与了大量的生物学过程，包括氧化还原平衡调节、细胞增长、分化和凋亡。PRX1蛋白具有抗氧化性已被越来越多的研究所证实。HYUNPARK等研究发现对南极鸭嘴椭圆双壳贝进行热激处理引起氧化

8、应激的实验中，对照组各组织中均检测到PRX1蛋白基因表达，在实验组的肝脏中该蛋白基因显著表达上调。这表明PRXIN6蛋白基因在热激引起的氧化应激反应中起到保护组织的作用，该蛋白具有抗氧化的功能29。目前已经在很多物种中克隆到PRX基因,例如类中的南极鸭嘴椭圆双壳贝29（ANTARCTICBIVALVELATERNULAELLIPTICA）,甲壳动物中的中华绒螯蟹31（CHINESEMITTENCRABERIOCHEIRSINENSES）以及真菌中的酿酒酵母32（SACCHAROMYCESCEREVISIAE）等。目前在头足类中尚无对PRX蛋白基因的研究。三、课题研究的主要内容、拟采取的技术路线

9、及实施方案、拟解决的关键技术和难点、预期达到的目标（一）课题研究的主要内容1曼氏无针乌贼PEROXIREDOXIN1蛋白基因CDNA序列全长的克隆2）曼氏无针乌贼PEROXIREDOXIN1蛋白在成体不同组织、胚胎不同发育期的表达差异（二）拟采取的技术路线及实施方案1、技术路线2、实施方案21CDNA文库构建取活力良好的曼氏无针乌贼墨囊，提取总MRNA，构建消减CDNA文库。EST测序，查找功能基因，得到目标PEROXIREDOXIN1蛋白基因EST序列。22PEROXIREDOXIN1蛋白CDNA全长扩增和序列分析221取活力良好的曼氏无针乌贼肝脏组织，用TRIZOL试剂提取乌贼肝脏组织总R

10、NA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，核酸定量仪测定RNA浓度。基于EST序列设计引物，3RACE样本采集总RNA提取CDNA文库构建测序及序列分析比对获得目标蛋白基因EST序列CDNA全长的克隆引物P1和P2；5RACE引物P3和P4，进行3RACE和5RACE。PCR产物纯化回收后,连接到载体，克隆测定。参考文献1张玺,齐钟彦贝类学纲要M科学出版社19612893502KAZOOUEDASTUDIESONTHEGROWTH,MATURATIONANDMIGRATIONOFTHESHIRIYAKEIKA,SEPIELLAJAPONICASASAKIJ198553583董正之世界海洋经济头足类

11、生物学M济南山东科学技术出版社19911972074MALCOLMRCLARKETHEROLEOFCEPHALOPODSINTHEWORLDSOCEANSGENERALCONCLUSIONANDTHEFUTUREPHILTRANSRSOCLONDB,1996351110511125吴耀泉,唐质灿黄河口及莱州湾哈曼氏无针乌贼的群体组成和洄游分布J水产学报19901421491526刘亚丹2001年世界头足类市场的特点J中国渔业经济20022507陈小蛾曼氏无针乌贼的主要营养成分研究J浙江海洋学院学报20001943243268肖述,郑小东,王如才头足类耳石轮纹研究进展J中国水产科学2003,10

12、173109齐中彦,马绣同,王祯瑞,等黄渤海的软体动物M北京农业出版社19893576910林福申我国的曼氏无针乌贼资源J海洋信息19915252611李星颉,戴建寿,唐志跃曼氏无针乌贼怀卵量及生殖力J浙江水产学院学报1985411712郭新,范广钻,郏国生浙江近海曼氏无针乌贼食性的初步分析J浙江水产学院学报19854214514613林福申我国的曼氏无针乌贼资源J海洋信息19915252614吴耀泉,唐质灿黄河口及莱州湾哈曼氏无针乌贼的群体组成和洄游分布J水产学报,1990,14214915215ROGERVILLANUEVA,JUANCDIFFERENTIALINCREMENTDEPSIT

13、IONRATEINEMBRYONICSTATOLITHSOFTHEOLIGINIDSQUIDLOLIGOVULGARISJMARINEBIOLOGY,1996,137116116816NIGMATULLINCMMASSSQUIDSOFTHESOUTHWESTATLANTICANDBRIEFSYNOPSISOFTHESQUIDIIIEXARGENTIMUSJFRENTEMARITIMO,1995,5718117王春琳,樊晓旭,余红卫等曼氏无针乌贼墨囊组织学及墨汁形成的超微结构动物学报,2008,54236637218PHEESG,KANGSW,CHANGTS,ETALPEROXIREDOXINA

14、NOVELFAMILYOFPEROXIDASESJIUBMBLIFE,2001,5212354119WANGX,PHELANSA,PETROSC,ETALPEROXIREDOXIN6DEFICIENCYANDATHEROSCLEROSISSUSCEPTIBILITYINMICESIGNIFICANCEOFGENETICBACKGROUNDFORASSESSINGATHEROSCLEROSISJATHEROSCLEROSIS,2004,1771617020CHANGTS,JEONGW,CHOISY,ETALREGLATIONOFPEROXIREDOXINACTIVITYBYCDC2MEDIATE

15、DPHOSPHORYLATIONJJBIOLCHEM,2002,27728253702537621PROSPERIMT,FERBUSD,KARCZINSKII,ETALAHUMANCDNACORRSPONDINGTOAGENEOVEREPRESSEDDURINGCELLPROLIFERATIONENCODESAPRODUCTSHARINGHOMOLOGYWITHAMOEBICANDBACTERIALPROTEINSJBIOLCHEM,1993,268110501105622KAWAIS,TAKESHITAS,OKAZAKIK,ETALCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFOS

16、F3,ANEWMEMBEROFTHEMER5FAMILY,EXPRESSEDINMOUSEOSTEROBLASTICCELLSJBIOCHEM,1994,11564164323NEMOTOY,YAMAMOTOT,TAKADAS,ETALANTISENSERNAOFTHELATENTPERIODGENEMER5INHIBITSTHEDIFFERENTIATIONOFMURINEERYTHROLEUKEMIACELLSGENE,1990,9126126524LEEK,PARKJS,KIMYJ,ETALDIFFERENTIALEXPRESSIONOFPRXANDINMOUSETESTISANDTHE

17、IRUPREGULATIONBYRADIATIONBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN,2002,29633734225章波,栗永萍,艾国平PERXIREDOXIN蛋白家族与电离辐射中华放射医学与防护杂志,2005,251959726YOYD,CHUNGYM,PARKJK,ETALSYNERGISTICEFFECTOFPEROXIREDOXINANTISENSEONCISPLATININDUCEDCELLDEATHEXPMOLMED2002,3427327727章波,向渝梅，白云抗氧化蛋白PEROXIREDOXIN家族研究进展生理科学进展,2004,3535235428叶伶,金美玲P

18、EROXIREDOXIN6具有双重酶活性的蛋白国际呼吸杂志,2007,27201593159529HYUNPARK,INYOUNGAHN,HAKJUNKIM,ETALANALYSISOFESTSANDEXPRESSIONOFTWOPEROXIREDOXINSINTHETHERMALLYSTRESSEDANTARCTICBIVALVELATERNULAELLIPTICAFISHSHELLFISHIMMUNOLOGY,2008,2555055930ANNAPALUMBO,MELANOGENESISINTHEINKGLANDOFSEPIAOFFICINALIS,PIGMENTCELL,2003,16

19、51752231CHANGKAOMU,ETALMOLECULARCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFPEROXIREDOXIN6FROMCHINESEMITTENCRABERIOCHEIRSINENSISFISHSHELLFISHIMMUNOLOGY26200971672332CHAEHZ,KIMIH,KIMK,RHEESGCLONING,SEQUENCING,ANDMUTATIONOFTHIOLSPECIFICANTIOXIDANTGENEOFSACCHAROMYCESCEREVISIAEJBIOLCHEM1993268，1681521毕业论文文献综述生物工程PEROXI

20、REDOXIN基因家族研究概况前言PEROXIREDOXIN是新近发现的抗氧化酶系，广泛存在于各种生物体内。根据分子所具有保守半胱氨酸数目的不同，哺乳动物的6个PEROXIREDOXIN分为2个亚类。PEROXIREDOXIN除了具有共同的抗氧化功能外，它还具有其它的功能如细胞增殖与分化、细胞信号转导及保护其它蛋白的氧化等。对该类蛋白质基因的克隆工作也随之展开。主题PEROXIREDOXIN蛋白是新近发现的一类过氧化物酶，其催化活性和蛋白序列与其它抗氧化剂完全不同。作为近年来研究的热点，它在清除活性氧族中具有重要作用。目前，已发现的PEROXIREDOXIN蛋白在SWISSPROT数据库中总共

21、有78个相关记录。本文就动物PEROXIREDOXIN蛋白家族的研究进展作简要的综述。曼氏无针乌贼SEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNE（以下简称乌贼），俗称墨鱼，属软体动物门（MOLLUSCA）、头足纲（CEPHALOPODA）、二腮亚纲（DIBRANCHIA）、十腕目（DECAPODA）、乌贼超科（SEPIACEA）、乌贼科（SEPIIDAE）、无针乌贼属（SEPIELLA）1，是沿海广温广布种，广泛分布于我国渤海、黄海、东海、南海以及日本东京湾、富山湾以西、韩国、马来群岛、菲律宾群岛、苏联远东海和印度洋海域23。我国曼氏无针乌贼资源数量较大，曾是浙江渔场四大渔业之一，

22、作为主要经济鱼种被捕捞，浙江省历史最高年产量（1957年）达到67万吨4。但由于过度捕捞，资源遭到很大破坏，渔汛消失，80年代后期，特别是90年代以来，种质资源明显衰减，产量急剧下降，目前仅作为兼捕对象56。关于曼氏无针乌贼形态构造，生态生理78以及渔业资源10等方面的研究已有零星报道，80年代，唐逸民和李星颉等人1114进行了乌贼增殖及繁殖保护工作作了一些调查研究的工作。在繁殖方面，国外学者ROPERV等（1996）观察了BRACHIOTEUTHISBEANIIVERRILL的交配现象15，YOUNGRE等（1985）研究了BRACHIOTEUTHISBEANIIVERRILL的卵与幼体，W

23、ATANABE1998研究了THYSANOTEUTHISRHOMBUS的胚胎发育，NIGMATULLINCM（1995）研究了THYSANOTEUTHISRHOMBUS的年龄、生长和繁殖生物学等16。乌贼墨汁储存于墨囊中，王春琳17等对曼氏无针乌贼墨囊进行了组织学及墨汁形成的超微结构，研究表明墨囊壁由外膜、肌肉层和黏膜三部分组成，墨腺体呈索状，集中于墨囊底部，墨汁颗粒以游离态形式分布于索状腺体的间隙及墨囊腔中。在具有分泌黑色素功能的B型细胞中可见黑色素颗粒储存在囊泡中，囊泡在移出细胞的过程中逐渐变大，泡内黑色素逐渐增多。囊泡可能通过胞吐的形式排出细胞外，黑色素排出后以颗粒的形式游离于细胞间隙中

24、，形成墨汁。有关乌贼的墨汁，具有凝血功能，作为一种中药被用于治疗多种妇科疾病，如功能性子宫出血、子宫痉挛和早起虚弱等病症。乌贼墨对非特异性免疫及特异性免疫功能均有影响。一方面能提高巨噬细胞活性,发挥非特异性免疫作用,抑制肿瘤生长另一方面,能作为免疫佐剂,促进抗体产生,提高特异性免疫功能,特别是体液免疫；在抗癌药物所致白细胞数低下时乌贼墨具有明显升白作用。一、PEROXIREDOXIN基因家族乌贼墨汁的主要成分黑色素的生物合成的最后一步需要在过氧化物酶的催化下完成30。本实验室构建了曼氏无针乌贼墨囊CDNA文库，并对其中的一万条EST序列进行测序，发现一千多条UNIQUEGENE。通过序列比对，

25、发现其中存在大量表达的过氧化物酶家族中的PEROXIREDOXIN1蛋白基因。PEROXIREDOXIN1蛋白基因属于过氧化物酶家族，是过氧化物还原酶（PEROXIREDOXIN,PRX）的第一个亚型。PEROXIREDOXIN属于抗氧化蛋白超家族，广泛存在于原核生物和真核生物中。第一个被发现的该家族蛋白是来源于酵母的25KD蛋白质，最初被命名为巯基特异性抗氧化酶。动物的PEROXIREDOXIN家族包括6个成员，PRXI、V和VI。6个成员的同源性比较结果表明PRXI的同源性相对较高；PRXV与其它成员的同源性约为10左右，没有显著的相似性；而PRXVI与另外4个成员的同源性相对较低，约为4

26、0左右。研究表明高等真核生物的同源基因在低等真核生物中仍具有功能，这显示该家族基因在进化上的保守性。该家族所有蛋白均在N端具有保守的CYS残基，有的成员在C端还具有保守的CYS。根据其保守CYS的数目不同，可以分为2个亚家族，即1一CYSPRX和2CYSPRX。前者仅在52位上有一个高度保守的半胱氨酸残基，后者则在52位和172位上分别有一个高度保守的半胱氨酸残基。PRXVI属于1CYSPRX，而其他成员属于2CYSPRX。然而，也有人根据各个成员间的同源性和保守CYS的不同而将它们分为3个亚类即2一CYSPRXI、非典型2CYSPRXV和1一CYSPRXVI。由于该基因家族在开始的研究中没有

27、形成统一的命名，因此家族中各个成员还有其它名称，详细见表1。表1PEROXIREDOXIN蛋白家族的其它名称规范名称其它名称PRXIPRXIIPRXIIIPRX1VPRXVPRXVINKEFA、PAG、MSP23、OSF一3、HBP23NKEFB、TPXIIMER5、AOP1、SP22AOE372无AOP2、1一CYSPRX其中PRXI定位于细胞质中。该蛋白在多种组织中表达，在成体肝脏、肾脏以及胚胎中均有较高水平的表达。此外，它还是一个可诱导的蛋白，在氧化应急条件下其表达显著增高，并高表达于一些恶性肿瘤细胞中。二、PEROXIREDOXIN蛋白的功能该家族基因所编码蛋白的生化功能是通过硫氧还蛋

28、白还原过氧化物或超氧化物，在消除代谢产生的过氧化物中具有重要作用。然而对该家族基因的生物学功能研究显示其还具有其他的活性参与细胞的增殖与分化；增强NK细胞的活性；保护自由基敏感蛋白；参与血红素的代谢；通过调节细胞内过氧化氢的浓度参与细胞因子信号的级联放大等。（一）抗氧化与自由基清除作用该家族蛋白均具有将过氧化氢还原为水的能力。其中2CYSPRX以硫氧还蛋白为电子受体，而1CYSPRX的电子受体还不明确。在氧应急条件下，该家族基因的表达被上调，以清除细胞内多余的活性氧分子。研究显示过氧化物可诱导小鼠巨噬细胞PRXI表达的升高。（二）细胞增殖与分化该基因家族的某些成员具有刺激细胞增殖的功能。PRX

29、I蛋白也被称为增殖相关蛋白，PROLIRMIONASSOCIATEDPROTEIN，PAG，与细胞增殖和分化密切相关。在原代培养的人乳腺上皮细胞系中，血清刺激能诱导PAG的表达升高，且RAS转化后的细胞对血清刺激的反应更明显。而在HL60细胞诱导分化时，细胞增殖停止，该基因的表达降低。这提示该基因与细胞增殖与分化是相关的。此外，PRXI蛋白也被称为造骨细胞特异因子OSTEOBLASTSPECIFICFACTOR，OSF3，是从造骨细胞系MC3T3E1中克隆，能促进骨细胞的增殖。PRX11也称MER5，由鼠红白血病细胞系MEL中克隆得到。研究证实，其反义RNA能抑制MEL细胞的分化，这提示该基因

30、产物与细胞增殖和分化相关。（三）参与细胞信号转导有证据表明，过氧化氢是细胞内的一种信号分子，其浓度在真核细胞中受到严格控制。过高的过氧化氢会损害细胞功能，甚至导致细胞死亡。作为细胞内信号分子，它可以与信号通路中蛋白质的巯基反应，使之活化或失活，参与信号转导。什么因素决定过氧化氢是一种氧化剂，还是细胞内有用的信号呢其中，PEROXIREDOXIN家族蛋白可能具有重要作用。另外，在一些细胞因子的信号转导中，过氧化氢具有重要的作用。（四）其它功能对该基因家族的深入研究还发现其某些成员具有其它功能。PRXI和具有增强NK细胞活性的能力。从K562细胞中克隆了NK细胞增强因子NKEF的2个亚基NKEFA

31、、NKEFB实际上就是PRXI和II。PRXI还具有结合血红素的功能，也被称为血红素结合蛋白HEMEBINDINGPROTEIN，HBP，其结合能力强于其它已知的蛋白。HEPA16细胞经过血红素处理后可以刺激其MRNA的升高1WAHARA等1995。三、PEROXIREDOXIN蛋白的抗氧化作用机制PEROXIREDOXIN不含有结合金属的离子，无需与金属离子结合就具有抗氧化作用。PEROXIREDOXIN含高度保守的具还原活性的半胱氨酸，与酶的抗氧化活性有关，该位点的突变研究证实了其为活性部位。两类PEROXIREDOXIN在作用机制上有所不同。2CYSPEROXIREDOXIN以同源二聚体

32、形式存在。在发挥抗氧化作用时，其一条肽链上的CYS巯基与另一肽链上的CYS”巯基之间脱氢形成分子间二硫键即CYSSSCYS”，以供氢而还原氧化，其中间产物为CYSSOH。然后再依靠硫氧还蛋白为供氢体将还原型辅酶的H转移至PEROXIREDOXIN，使其恢复原来的结构和功能。故其还原能力最终来自还原型辅酶。体外研究显示当缺乏生理性供氢体时，一些小分子物质如二硫苏糖醇D33“、巯基乙醇等可以作为其供氢体，但是谷胱甘肽不能作为供氢体。在发挥功能时，有部分蛋白被过氧化为CYSSOH而失活。PRXV在发挥氧化还原功能时，其作用机制与前者有所区别它依靠分子内二硫键CYSSSCYS的形成来供氢，而由硫氧还蛋

33、白将其还原。1一CYSPEROXIREDOXIN因仅含一个CYS残基，故主要是通过肽链CYS氧化为CYSSOH而提供氢离子来还原氧化物，其供氢体不明确。其作用机制尚需进一步研究。四、PEROXIREDOXIN与肿瘤细胞的氧化还原状态与肿瘤的形成密切相关，而参与控制细胞氧化还原状态的基因也因此与肿瘤的形成有一定的关联。越来越多的证据显示PEROXIREDOXIN与肿瘤有关，甚至有人认为PEROXIREDOXIN可能是肿瘤的一个标志。CHOIJH研究发现，PRX的表达在肝癌细胞中比相邻组织高，说明它可能与生理科学进展2004年第35卷第4期肝癌的形成和发展有关。在24个乳腺癌标本中，PRXI在21

34、个标本中呈高表达，PRXI1在18个标本中呈高表达，PRX在19个标本中呈高表达，但是PEROXIREDOXIN的高表达与乳腺癌的临床病理参数没有相关性。提示PEROXIREDOXIN具有生长促进作用，在肿瘤的发生与发展中具有重要作用。此外，在对去氧胆酸钠所诱导细胞凋亡具有抗性的结肠癌细胞系HCT一116中，其PRXI1和PRXIV表达升高。这表明PEROXIREDOXIN可能具有抗细胞凋亡的作用CROWLEYWEBER等2002。同样，通过双向电泳技术比较正常肺上皮细胞和恶性转化细胞A549的蛋白质组，PRXI在A549细胞中的表达较正常升高2倍多，它可能是肺癌的一个基因标志。除了这些组织外

35、，在人甲状腺瘤和甲状腺炎组织中，PRXI的表达水平也较正常对照组织的表达升高。这些均提示PEROXIREDOXIN与肿瘤的相关性。另一方面，也有证据从反面证实PEROXIREDOXIN与肿瘤的关系。抗肿瘤药物顺铂可以诱导肿瘤细胞的凋亡，若向细胞转染PRXI1基因则可以增强细胞对顺铂的抵抗，细胞的存活增加。相反，向细胞转染PRXI1基因的反义核酸则促进顺铂诱导的细胞死亡，与顺铂具有协同作用，其反义核酸可以作为顺铂治疗肿瘤的增敏剂。乌贼墨汁储存于墨囊中，王春琳17等对曼氏无针乌贼墨囊进行了组织学及墨汁形成的超微结构，研究表明墨囊壁由外膜、肌肉层和黏膜三部分组成，墨腺体呈索状，集中于墨囊底部，墨汁颗

36、粒以游离态形式分布于索状腺体的间隙及墨囊腔中。在具有分泌黑色素功能的B型细胞中可见黑色素颗粒储存在囊泡中，囊泡在移出细胞的过程中逐渐变大，泡内黑色素逐渐增多。囊泡可能通过胞吐的形式排出细胞外，黑色素排出后以颗粒的形式游离于细胞间隙中，形成墨汁。有关乌贼的墨汁，具有凝血功能，作为一种中药被用于治疗多种妇科疾病，如功能性子宫出血、子宫痉挛和早起虚弱等病症。乌贼墨对非特异性免疫及特异性免疫功能均有影响。一方面能提高巨噬细胞活性,发挥非特异性免疫作用,抑制肿瘤生长另一方面,能作为免疫佐剂,促进抗体产生,提高特异性免疫功能,特别是体液免疫；在抗癌药物所致白细胞数低下时乌贼墨具有明显升白作用。五、展望PE

37、ROXIREDOXIN是一种新发现的抗氧化酶系，在生物体内对活性氧族的清除中发挥重要作用。随着研究的深入，该蛋白家族的生理、生化功能已清楚地呈现在人们面前，且其个别成员新的生理作用也不断被发现。是否还存在该家族的新成员呢目前，人类基因组计划的完成为回答此问题提供了便利。此外，该家族蛋白与肿瘤的关系值得思考，它也许能为肿瘤的治疗提供新的途径。总结PEROXIREDOXINS蛋白家族基因所编码蛋白的生化功能是通过硫氧还蛋白还原过氧化物或超氧化物，在消除新陈代谢产生的过氧化物中具有重要作用。另外，该家族的个别成员还显示其他的活性参与细胞的增殖与分化2123；增强NK细胞的活性；保护自由基敏感蛋白；参

38、与血红素的代谢；参与某些细胞因子的信号转导24等。另外，PEROXIREDOXIN蛋白家族与肿瘤的关系密切25。该家族蛋白在多种肿瘤细胞中均具有较高表达，可能是肿瘤的一种潜在的标志物26。主要参考文献1张玺,齐钟彦贝类学纲要M科学出版社19612893502KAZOOUEDASTUDIESONTHEGROWTH,MATURATIONANDMIGRATIONOFTHESHIRIYAKEIKA,SEPIELLAJAPONICASASAKIJ198553583董正之世界海洋经济头足类生物学M济南山东科学技术出版社19911972074MALCOLMRCLARKETHEROLEOFCEPHALOPOD

39、SINTHEWORLDSOCEANSGENERALCONCLUSIONANDTHEFUTUREPHILTRANSRSOCLONDB,1996351110511125吴耀泉,唐质灿黄河口及莱州湾哈曼氏无针乌贼的群体组成和洄游分布J水产学报19901421491526刘亚丹2001年世界头足类市场的特点J中国渔业经济20022507陈小蛾曼氏无针乌贼的主要营养成分研究J浙江海洋学院学报20001943243268肖述,郑小东,王如才头足类耳石轮纹研究进展J中国水产科学2003,10173109齐中彦,马绣同,王祯瑞,等黄渤海的软体动物M北京农业出版社19893576910林福申我国的曼氏无针乌贼资

40、源J海洋信息19915252611李星颉,戴建寿,唐志跃曼氏无针乌贼怀卵量及生殖力J浙江水产学院学报1985411712郭新,范广钻,郏国生浙江近海曼氏无针乌贼食性的初步分析J浙江水产学院学报19854214514613林福申我国的曼氏无针乌贼资源J海洋信息19915252614吴耀泉,唐质灿黄河口及莱州湾哈曼氏无针乌贼的群体组成和洄游分布J水产学报,1990,14214915215ROGERVILLANUEVA,JUANCDIFFERENTIALINCREMENTDEPSITIONRATEINEMBRYONICSTATOLITHSOFTHEOLIGINIDSQUIDLOLIGOVULGARI

41、SJMARINEBIOLOGY,1996,137116116816NIGMATULLINCMMASSSQUIDSOFTHESOUTHWESTATLANTICANDBRIEFSYNOPSISOFTHESQUIDIIIEXARGENTIMUSJFRENTEMARITIMO,1995,5718117王春琳,樊晓旭,余红卫等曼氏无针乌贼墨囊组织学及墨汁形成的超微结构动物学报,2008,54236637218PHEESG,KANGSW,CHANGTS,ETALPEROXIREDOXINANOVELFAMILYOFPEROXIDASESJIUBMBLIFE,2001,5212354119WANGX,PHE

42、LANSA,PETROSC,ETALPEROXIREDOXIN6DEFICIENCYANDATHEROSCLEROSISSUSCEPTIBILITYINMICESIGNIFICANCEOFGENETICBACKGROUNDFORASSESSINGATHEROSCLEROSISJATHEROSCLEROSIS,2004,1771617020CHANGTS,JEONGW,CHOISY,ETALREGLATIONOFPEROXIREDOXINACTIVITYBYCDC2MEDIATEDPHOSPHORYLATIONJJBIOLCHEM,2002,27728253702537621PROSPERIMT

43、,FERBUSD,KARCZINSKII,ETALAHUMANCDNACORRSPONDINGTOAGENEOVEREPRESSEDDURINGCELLPROLIFERATIONENCODESAPRODUCTSHARINGHOMOLOGYWITHAMOEBICANDBACTERIALPROTEINSJBIOLCHEM,1993,268110501105622KAWAIS,TAKESHITAS,OKAZAKIK,ETALCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFOSF3,ANEWMEMBEROFTHEMER5FAMILY,EXPRESSEDINMOUSEOSTEROBLASTICC

44、ELLSJBIOCHEM,1994,11564164323NEMOTOY,YAMAMOTOT,TAKADAS,ETALANTISENSERNAOFTHELATENTPERIODGENEMER5INHIBITSTHEDIFFERENTIATIONOFMURINEERYTHROLEUKEMIACELLSGENE,1990,9126126524LEEK,PARKJS,KIMYJ,ETALDIFFERENTIALEXPRESSIONOFPRXANDINMOUSETESTISANDTHEIRUPREGULATIONBYRADIATIONBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN,2002,29633

45、734225章波,栗永萍,艾国平PERXIREDOXIN蛋白家族与电离辐射中华放射医学与防护杂志,2005,251959726YOYD,CHUNGYM,PARKJK,ETALSYNERGISTICEFFECTOFPEROXIREDOXINANTISENSEONCISPLATININDUCEDCELLDEATHEXPMOLMED2002,3427327727章波,向渝梅，白云抗氧化蛋白PEROXIREDOXIN家族研究进展生理科学进展,2004,3535235428叶伶,金美玲PEROXIREDOXIN6具有双重酶活性的蛋白国际呼吸杂志,2007,27201593159529HYUNPARK,I

46、NYOUNGAHN,HAKJUNKIM,ETALANALYSISOFESTSANDEXPRESSIONOFTWOPEROXIREDOXINSINTHETHERMALLYSTRESSEDANTARCTICBIVALVELATERNULAELLIPTICAFISHSHELLFISHIMMUNOLOGY,2008,2555055930ANNAPALUMBO,MELANOGENESISINTHEINKGLANDOFSEPIAOFFICINALIS,PIGMENTCELL,2003,1651752231CHANGKAOMU,ETALMOLECULARCLONINGANDCHARACTERIZATIONO

47、FPEROXIREDOXIN6FROMCHINESEMITTENCRABERIOCHEIRSINENSISFISHSHELLFISHIMMUNOLOGY26200971672332CHAEHZ,KIMIH,KIMK,RHEESGCLONING,SEQUENCING,ANDMUTATIONOFTHIOLSPECIFICANTIOXIDANTGENEOFSACCHAROMYCESCEREVISIAEJBIOLCHEM19932681681521本科毕业设计（20_届）曼氏无针乌贼过氧化物还原酶PEROXIREDOXIN1基因的克隆目录中英文摘要1引言172PRX1基因全长的克隆及序列分析1821材

48、料与方法18211实验试剂及配置方法18212主要仪器设备1822曼式无针乌贼总RNA的提取19221曼式无针乌贼目标基因片段的获得19222曼氏无针乌贼3RACE末端扩增2023PCR产物的切胶纯化回收213实验结果2331曼式无针乌贼总RNA的提取23323RACE扩增曼式无针乌贼PRX1基因3末端2333SMPRX1基因的核苷酸分析254总结3041结论3042创新点3143展望31参考文献31附录错误未定义书签。摘要摘要曼氏无针乌贼资源数量较大，作为主要经济鱼种是浙江沿海传统捕捞对象。但由于过度捕捞，乌贼的资源锐减。因此，对曼氏无针乌贼进行生化分子机制的研究工作显得尤为迫切。本研究采用

49、大规模EST测序方法，结合末端快速扩增（RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS，RACE）技术从曼氏无针乌贼墨囊中克隆到过氧化物还原酶1（PROXIREDOXIN1，SMPRX1）基因的CDNA序列全长；PRX1基因的CDNA全长为1052BP，5UTR为79BP，3UTR为352BP，开放阅读框（OPENREADINGFRAME，ORF）为621BP，编码206个氨基酸。MRNA3端具有推测的多聚腺苷酸加尾信号（POLYADENYLATIONSIGNAL）AATAAA和POLYA尾巴。PRX1的预测分子量为244KDA，理论等电点为663。关键词曼氏无针乌贼；过氧化物还原酶1；基因克隆；基因表达ABSTRACTABSTRACTSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNEISANIMPORTANTECONOMICFISHERYRESOURCES,ISZHEJIANGCOASTALTRADITIONALFISHINGOBJECTBUTDUETOOVERFISHING,THESQUIDSRESOURCESDOWNSHARPLYTHEREFORE,SEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNEOFBIOCHEMICALRE