三疣梭子蟹蜕皮周期中蜕皮激素浓度的变化【开题报告+文献综述+毕业设计】.Doc

1、本科毕业论文系列开题报告生物技术三疣梭子蟹蜕皮周期中蜕皮激素浓度的变化一、选题的背景与意义三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS），隶属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。其生长迅速，养殖利润丰厚，肉多，脂膏肥满，味鲜美，营养丰富。每百克蟹内含蛋白质14克、脂肪26克。鲜食以蒸食为主，还可盐渍加工“枪蟹”、蟹酱，蟹卵经漂洗晒干即成为“蟹籽”，均是海味品中之上品，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。梭子蟹一般在35米深海底生活及繁殖，冬天移居到1030米的深海，喜在泥沙底部穴居。目前国内也有人对甲壳动物中有关蜕皮激素做了研究，如叶海辉等采用组织切片和电镜技术

2、，对锯缘青蟹大颚器、Y器的形态结构进行了观察，以及赵维信、陆剑峰对中华绒螯蟹ERIOCHEIRSINENSISY器官在蜕皮周期中的超微结构，进而指出其对蜕皮过程的影响。国内很少有人研究三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）的蜕皮周期，作为中国沿海重要的经济蟹类，刚蜕完壳的软壳蟹的体积比蜕壳前增加了3040,其壳通过环境中的钙盐等不断硬化而恢复正常硬度，三疣梭子蟹的个体增长在外表上并不连续，而是呈阶梯形，每蜕一次皮，上一个台阶。由此可见，三疣梭子蟹的生长发育与蜕皮息息相关，促进蜕皮的发生，可促进其发育成熟，提高产量。了解蜕皮发生的时间，周期的长短对促进沿海三疣梭子蟹养殖业的

3、发展非常重要。Y器又称为蜕皮腺，与昆虫的前胸腺为同功器官。1953年GABE首次描述了58种软甲亚纲MALACOSTRACA种类的Y器，而切甲亚纲ENTOMOSTRACA种类没有Y器1。Y器分泌的蜕皮类固醇不具生物活性，只有进入血淋巴，在外周组织20羟化酶的催化作用下才转化成具有生物活性的20羟蜕皮酮。研究表明，20羟蜕皮酮不仅参与甲壳动物的蜕皮活动和胚胎发育，而且参与了卵巢发育过程2。如日本沼虾MACROBRACHIUMNIPPONENSE、中华绒螯蟹ERIOCHEIRSINENSIS、中国对虾PENAEUSCHINENSIS血淋巴中20羟蜕皮酮的周期性变化均与卵巢发育相关联36。利用高效液

4、相色谱电喷雾串联质谱（LCMS/MS）法完成三疣梭子蟹蜕皮过程中血淋巴蜕皮激素浓度变化的测定，对所得数据进行统计学分析，为海洋甲壳动物蜕皮等生长发育过程的生理学研究提供参考。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1、利用高效液相色谱电喷雾串联质谱（LCMS/MS）法完成三疣梭子蟹蜕皮过程中血淋巴蜕皮激素浓度变化的测定。2、对所得数据进行统计学分析。拟解决的问题三疣梭子蟹蜕皮周期中蜕皮激素浓度的变化。三、研究的方法与技术路线研究方法1、实验材料三疣梭子蟹在宁波宁海长街得水育苗场购得，雌雄各半。体宽在911CM之间，体重在4565G之间，实验样本均为未经过生殖蜕皮的三疣梭子蟹。2、参照

5、传统甲壳动物蜕皮阶段的划分，结合三疣梭子蟹类本身所独有的特点，以游泳足末节新旧表皮间距/旧表皮厚度的比值为主要依据，1）血淋巴蜕皮激素的提取从蟹的游泳足基部抽取300L血淋巴，加入含有1200L乙腈和20L100NG/ML内标的15ML离心管内，轻微涡旋震荡，8500R/MIN高速离心15MIN。而后吸取上清液1ML（勿将底部蛋白吸入）于灭菌15ML离心管中，做好标记。冰箱下层20保存一周以内。2）血淋巴蜕皮激素浓度的变化的测量将上清液旋转蒸发，用02ML纯甲醇复溶，进行液质分析。根据样品中20羟基蜕皮酮（20E）特征离子响应强度与内标物高油菜素内酯的特征离子响应强度比值，用加入内标的工作曲线

6、法求得样品中20羟基蜕皮酮的含量。3）绘制统计图表进行分析。技术路线四、研究的总体安排与进度201010毕业论文选题；201010201011进行文献查阅和资料收集；201011201012完成任务书、开题报告、综述，进行开题答辩；2011120112完成两篇外文文献的翻译；2011220114进行论文实验，然后再把实验的数据整理，完成毕业论文高速离心于15ML离心管漩涡震荡内吸取上清液1ML冰箱下层20保存将上清液旋转蒸发02ML纯甲醇复溶加入内标的工作曲线法求得样品中20羟基蜕皮酮的含量8500R/MIN，15MIN于灭菌15ML离心管中血淋巴的提取不超过1周时间液质分析20羟基蜕皮酮（2

7、0E）特征离子响应强度/内标物高油菜素内酯的特征离子响应强度绘制统计图表进行分析整理数据、表格，撰写论文20115进行毕业答辩五、主要参考文献1LACHAISEF，LEROUXA，HUBERTM，ETA1THEMOLTINGGLANDOFCRUSTACEANSLOCALIZATION，ACTIVITYANDENDOCRINECONTROLAREVIEWJJCRUSTBIO1，1993，131982342SUBRAMONIAMTCRUSTACEANECDYSTERIODSINREPRODUCTIONANDEMBRYOGENESISJCOMPBIOEHEMPHYSIO1，2000，125C1351

8、563OKUMURAT，HANCH，SUZUKIY，ETA1CHANGESINHEMOLYMPHVITELLOGENINANDECDYSTEROIDLEVELSDURINGTHEREPRODUCTIVEANDNONREPRODUCTIVEMOLTCYCLESINTHEFRESHWATERPRAWN，MACROBRACHIUMNIPPONENSEJZOO1SEI，1992，937454罗荣生，王幽兰，曹梅讯等中华绒螯蟹血淋巴20羟蜕皮酮诱发蜕皮和卵巢发育的作用J动物学报，1990，3621571645姜仁良，谭玉钧，吴嘉敏等中华绒螫蟹血淋巴中2O羟蜕皮酮17雌二醇和皋酮含量的变化J水产学报，19

9、92，16210L1066赵维信，王义强，欧阳奋春中国对虾体内2O羟基蜕皮酮含量与生长和性腺发育关系J台湾海峡，1992，LL43053097叶海辉,李少菁,黄辉洋等锯缘青蟹器结构与卵巢发育的研究J厦门大学学报,2002,4167917958赵维信，陆剑峰中华绒螯蟹Y器官在蜕皮周期中的超微结构J中国水产科学，2004，11174769朱小明，李少菁甲壳动物幼体蜕皮的调控J水产学报，2001，25437938410赵红霞甲壳动物蜕皮调控研究及蜕壳素的使用J广东饲料，2006，151323511姚俊杰，赵云龙甲壳动物蜕皮的调节机制研究进展J水利渔业，2006，266810，10812亓一舟，朱冬发

10、，杨济芬等甲壳动物蜕皮抑制激素调控机制的研究进展J动物学杂志，2010，45216517013秦昆，康现江，郭明申等三疣梭子蟹Y器、大颚器显微及超微结构研究J台湾海峡，2007，261768414叶海辉,李少菁,黄辉洋,等锯缘青蟹大颚器的显微和超微结构J海洋学报,2005,27112012415刘智俊，吴旭干，成永旭等三疣梭子蟹卵巢发育期间Y器官组织学变化J上海海洋大学学报，2010，（3）31432016薛俊增，堵南山，赖伟等中国三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUSMIERS的研究东海海洋，1997，154606517杜育哲，顾景龄中华绒螯蟹大颚器官超微结构的研究J南开大

11、学学报，2000，3321071L018上官步敏，李少菁锯缘青蟹窦腺显微和超微结构研究J动物学报，1995，41434134619上官步敏，李少菁锯缘青蟹X器官神经分泌细胞的细胞学研究J海洋学报，1994，16611612120蔡生力甲壳动物内分泌学研究与展望J水产学报，1998，22215416121阎斌伦，梁利国，张晓君三疣梭子蟹主要病害研究进展J水产科技情报，2010，12933,3722王建平，余晓巍，周志强等宁波市三疣梭子蟹主要病害流行特征及应对措施J河北渔业，20089495323赵鹏，徐继林，亓一舟等高效液相色谱三重四级杆质谱分析海洋甲壳动物淋巴和肌肉中的20羟基蜕皮酮J分析化学

12、研究报告，2011，39（1）576124LIMAYAVARAMBAN,DDHAYAPARAN,HALAGOWDERDEVARAJMOLECULARMECHANISMOFMOLTINHIBITINGHORMONEMIHINDUCEDSUPPRESSIONOFECDYSTEROIDOGENESISINTHEYORGANOFMUDCRABSCYLLASERRATAFEBSLETTERS581,2007,5167517225CORNELIABUCHHOLZ,DIETERADELUNGTHEULTRASTRUCTURALBASISOFSTERIODPRODUCTIONINTHEYORGENANDTHE

13、MANDDIBULARORGANOFTHECRABSHEMIGRAPSUSNUDUSDANAANDCARCINUSMAENASLCELLTISSUERES1980,206,839426JUNYINGZHENG,TERUAKINAKATSUJI,ROBERTDROER,RDOUGLASWATSONSTUDIESOFARECEPTORGUANYLYLCYCLASECLONEDFROMYORGANSOFTHEBLUECRABCALLINECTESSAPIDUS,ANDITSPOSSIBLEFUNCTIONALLINKTOECDYSTEROIDOGENESISGENERALANDCOMPARATIVE

14、ENDOCRINOLOGY155,2008,780788毕业论文文献综述生物技术甲壳动物蟹类中Y器的研究进展摘要作为虾蟹类中一个重要的器官，Y器YORGAN，Y0在虾蟹的生长发育中起着不可忽视的作用。它是甲壳动物的蜕皮腺,是与昆虫前胸腺同源的器官,分泌蜕皮激素蜕皮类固醇激素,其主要作用是控制蜕皮。本文主要对中华绒螯蟹、锯缘青蟹、三疣梭子蟹的研究现状和最新进展做一个总结。关键词Y器，中华绒螯蟹，锯缘青蟹，三疣梭子蟹前言Y器又称为蜕皮腺，与昆虫的前胸腺为同功器官1953年GABE首次描述了58种软甲亚纲MALACOSTRACA种类的Y器，而切甲亚纲ENTOMOSTRACA种类没有Y器1。Y器分泌的

15、蜕皮类固醇不具生物活性，只有进入血淋巴，在外周组织20羟化酶的催化作用下才转化成具有生物活性的2O一羟蜕皮酮。研究表明，20羟蜕皮酮不仅参与甲壳动物的蜕皮活动和胚胎发育，而且参与了卵巢发育过程2。如日本沼虾MACROBRACHIUMNIPPONENSE、中华绒螯蟹ERIOCHEIRSINENSIS、中国对虾PENAEUSCHINENSIS血淋巴中20羟蜕皮酮的周期性变化均与卵巢发育相关联36。有关甲壳动物Y器的解剖定位和形态结构，国内尚未见诸报道。随着各种虾蟹类在市场上需求的扩大，现有的人工养殖也不能完全满足市场的需求，所以如何提高一些虾蟹幼苗的产量是一个我们急需解决的问题。开展Y器结构与功能

16、的研究，对于了解蟹虾类生长、生殖的内分泌调控过程具有重要的意义。1中华绒螯蟹中Y器的研究中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSISMILNEEDWARDS）中华绒螯蟹是一种经济蟹类，我国境内广泛分布于我国南北沿海各地湖泊。关于中华绒螯蟹的蜕皮激素已有报道34，但有关中华绒螯蟹Y器官的定位、组织学和超微结构仅见于赵维信，陆剑峰的中华绒螯蟹Y器官在蜕皮周期中的超微结构8。中华绒螯蟹YO超微结构的观察表明,在蜕皮周期的不同阶段蜕皮间期、蜕皮前期和蜕皮后期，YO细胞超微结构呈现周期性变化。YO细胞的典型特征表现在蜕皮前期最为明显，具有发达的光面内质网、管嵴状线粒体以及大量游离核糖体。光面内质网和管

17、嵴状线粒体的结构与脊椎动物类固醇激素合成有关的超微结构特征一致；游离核糖体的大量存在，表明主要合成细胞的结构蛋白和本身所需要的酶蛋白等，而不是主要合成向外输送的分泌性蛋白，如蛋白质类激素等。蜕皮前期存在的胞质呈泡状化的YO细胞，显示了激素分泌状态下的YO细胞形态，是不同生理状况下的表现,因此YO的细胞索是由单一的一种细胞构成。蜕皮间期和蜕皮后期的YO细胞体积均较蜕皮前期小，胞质中细胞器较少，特别是光面内质网罕见，而蜕皮前期的样品，却与前两者显著不同，YO细胞的光面内质网明显增加。这与处于蜕皮前期D1期的近方蟹HEMIGRAPSUSNUDUSYO细胞观察到大量光面内质网相类似,揭示光面内质网与蜕

18、皮激素的合成有重要关系，这与中华绒螯蟹血淋巴20羟蜕皮酮20HE水平在蜕皮前期D期达到峰值，蜕皮后期A期急剧下降相吻合4、5。YO细胞与血窦的相邻面形成许多胞突，其功能对增加与血淋巴进行物质交换的表面积有关。中华绒螯蟹的青春蜕皮又称生殖蜕皮一般出现在每年9月下旬秋分前后是个体生命过程中最后一次蜕皮，由黄蟹幼蟹变成绿蟹，性腺开始迅速发育。至卵母细胞成熟期，血淋巴20HE保持在低于正常蜕皮间期的20HE水平4，这与青春蜕皮后YO细胞出现凋亡，整个YO机能趋向生理退化相一致。在中华绒螯蟹YO的血窦中观察到无颗粒型血细胞和颗粒型血细胞两类，血细胞具有伪足,揭示具有吞噬能力，可能与去除退化的YO细胞有关

19、8,17。2锯缘青蟹中Y器的研究锯缘青蟹（SCYLLASERRATA）肉质鲜美，营养丰富，其雌蟹更是有有“海上人参”之称。盛产于温暖的浅海中，主要分布在中国广东、广西、福建和台湾的沿海等地，江浙一带尤多。开展Y器结构与功能的研究对于了解锯缘青蟹生长、生殖的内分泌调控过程具有重要的意义7,912。21Y器的结构光镜下，锯缘青蟹Y器不具有导管，由多个小叶组成，具有丰富的血窦和血管。腺细胞呈上皮样，排列紧密，靠近血窦的一侧胞突明显。这些结构显示了内分泌腺的特征。电镜下，细胞核几乎占据了整个腺细胞，核内异染色质丰富，胞质稀少，细胞突起多，线粒体常见，具有管状嵴，但高尔基体不发达，滑面内质网极少。与哺乳

20、动物典型类固醇分泌细胞高尔基体发达，滑面内质网丰富的特征不同，而与普通滨蟹CARCINUSMAENAS、近方蟹HEMIGRAPSUSNUDUS和首长黄道蟹CANCERANTENNARIUS的观察相似7。Y器腺细胞胞质少，细胞器不发达的特点，或许与甲壳动物不能合成胆固醇的生化特性有关。锯缘青蟹Y器腺细胞质膜紧密相邻，具有大量相互交错的胞突，血窦旁腺细胞的胞突尤为明显，有利于细胞之间以及细胞与血淋巴之间的物质交换和信息传递。22Y器与卵巢发育研究表明，甲壳动物Y器不能合成类固醇前体，但能够迅速吸收和转化食物中的胆固醇来合成蜕皮类固醇7。在卵巢发育早期卵黄发生前期卵母细胞，锯缘青蟹Y器内具有巨大脂肪

21、球，为腺细胞快速利用类固醇提供了物质基础。在卵巢将成熟期卵黄发生期卵母细胞，Y器腺细胞染色质高度固缩，多泡小体、髓样小体和大空泡增多，线粒体内嵴膨大或消失。腺细胞内小泡数量减少，大泡增多，或许与细胞分泌后小泡融合为大泡有关，推测小泡在合成与分泌蜕皮类固醇过程具有重要作用；多泡小体和髓样小体这类次级溶酶体数量的增多，表征着腺细胞分泌作用减弱。免疫电镜研究证实，泥污鲸螯虾ORCONECTESLIMOSUS蜕皮类固醇的免疫阳性部位主要集中于线粒体的管状嵴，线粒体与蜕皮类固醇合成密切相关7。在锯缘青蟹卵巢将成熟期，Y器腺细胞线粒体的结构发生了显著的变化，其内嵴消失或异常膨大，极可能与腺细胞分泌作用减弱

22、有关。在卵巢将成熟期，观察到不少腺细胞处于退化状态，进一步提示了该期不需要或仅需要低浓度的蜕皮类固醇7。锯缘青蟹Y器超微结构的变化，为参与卵黄发生与卵巢发育的生理作用提供了形态学依据。今后在不同卵巢发育期开展蜕皮类固醇分泌水平的研究，将有助于加深对锯缘青蟹Y器结构与功能的认识14,18,19。3、三疣梭子蟹中Y器的研究三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS），隶属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。其生长迅速，养殖利润丰厚，肉多，脂膏肥满，味鲜美，营养丰富。每百克蟹内含蛋白质14克、脂肪26克。鲜食以蒸食为主，还可盐渍加工“枪蟹”、蟹酱，蟹卵经漂洗晒干即成

23、为“蟹籽”，均是海味品中之上品，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。三疣梭子蟹Y器的解剖学位置、组织学和超微结构特征与一些研究过的甲壳动物，如真蟹CARCINUSMAENAS、锯缘青蟹SCYLLASERRATA、中华绒螯蟹ERIOCHEIRSINESIS等基本相似13。Y器由许多不规则的小叶组成，具有丰富的血窦和血管。这些结构显示了内分泌腺的特征。细胞核几乎占据了整个腺细胞，核内染色质丰富，胞质较少，细胞突起多，线粒体常见，具有管状嵴，但高尔基体不发达，内质网少。这与哺乳动物典型类固醇分泌细胞高尔基体发达，滑面内质网丰富的特征不同。Y器腺细胞胞质少，细胞器不发达的特点，可能与甲壳动物不能合成胆

24、固醇，但能将食物中的胆固醇转化为固醇类蜕皮激素的生化特性有关。腺细胞质膜紧密相邻，具有大量相互交错的胞突，尤其在靠近血淋巴窦的部位有大量膜质的内陷和皱褶，这样的膜质结构是对内分泌活动的一种适应，这样的结构能极大地增加腺细胞与血淋巴之间的有效接触面积，有利于细胞之间以及细胞与血淋巴之间的物质交换和信息传递，有利于胞吐作用或渗透作用，使腺细胞分泌的蜕皮类固醇更容易释放到血淋巴中。细胞质膜外侧的基膜增厚可能与防止细胞合成产物扩散有关。多层同心环状的滑面内质网和管嵴状线粒体与细胞产物的合成有关，是细胞合成类固醇激素的结构基础。腺细胞内小泡在合成与分泌蜕皮类固醇过程具有重要作用18,19。高尔基体旁的大

25、泡是小泡融合形成。三疣梭子蟹血淋巴细胞分为大颗粒细胞、小颗粒细胞、无颗粒细胞三类20，在Y器血窦中观察到颗粒型和无颗粒型血细胞，其中颗粒型血细胞的胞质中有很多体积大的颗粒，也就是大颗粒细胞2123。这与赵维信等在中华绒螯蟹中观察到的基本类似6。Y器是与昆虫的前胸腺同源的器官。分泌的蜕皮激素在外周组织20羟化酶的催化作用下才转化成具有生物活性的20羟蜕皮酮。20羟蜕皮酮器不仅参与甲壳动物的蜕皮活动和胚胎发育，而且参与了卵巢发育过程2426。参考文献11LACHAISEF,LEROUXA,HUBERTM,ETA1THEMOLTINGGLANDOFCRUSTACEANSLOCALIZATION,AC

26、TIVITYANDENDOCRINECONTROLAREVIEWJJCRUSTBIO1,1993,1319823422SUBRAMONIAMTCRUSTACEANECDYSTERIODSINREPRODUCTIONANDEMBRYOGENESISJCOMPBIOEHEMPHYSIO1,2000,12513515633OKUMURAT,HANCH,SUZUKIY,ETA1CHANGESINHEMOLYMPHVITELLOGENINANDECDYSTEROIDLEVELSDURINGTHEREPRODUCTIVEANDNONREPRODUCTIVEMOLTCYCLESINTHEFRESHWATER

27、PRAWN,MACROBRACHIUMNIPPONENSEJZOO1SEI,1992,9374544罗荣生,王幽兰,曹梅讯,等中华绒螯蟹血淋巴20羟蜕皮酮诱发蜕皮和卵巢发育的作用J动物学报,1990,36215716455姜仁良,谭玉钧,吴嘉敏,等中华绒螫蟹血淋巴20羟蜕皮酮17雌二醇和皋酮含量的变化J水产学报,1992,16210L10666赵维信,王义强,欧阳奋春中国对虾体内20羟基蜕皮酮含量与生长和性腺发育关系J台湾海峡,1992,11430530977叶海辉,李少菁,黄辉洋,等锯缘青蟹器结构与卵巢发育的研究J厦门大学学报,2002,41679179588赵维信,陆剑峰中华绒螯蟹Y器官在

28、蜕皮周期中的超微结构J中国水产科学,2004,111747699朱小明,李少菁甲壳动物幼体蜕皮的调控J水产学报,2001,2543793841010赵红霞甲壳动物蜕皮调控研究及蜕壳素的使用J广东饲料,2006,15132351111姚俊杰,赵云龙甲壳动物蜕皮的调节机制研究进展J水利渔业,2006,266810,1081212亓一舟,朱冬发,杨济芬,等甲壳动物蜕皮抑制激素调控机制的研究进展J动物学杂志,2010,4521651701313秦昆,康现江,郭明申,等三疣梭子蟹Y器、大颚器显微及超微结构研究J台湾海峡,2007,26176841414叶海辉,李少菁,黄辉洋,等锯缘青蟹大颚器的显微和超微

29、结构J海洋学报,2005,2711201241515刘智俊,吴旭干,成永旭,等三疣梭子蟹卵巢发育期间Y器官组织学变化J上海海洋大学学报,2010,33143201616薛俊增,堵南山,赖伟等中国三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS的研究东海海洋,1997,15460651717杜育哲,顾景龄中华绒螯蟹大颚器官超微结构的研究J南开大学学报,2000,3321071L01818上官步敏,李少菁锯缘青蟹窦腺显微和超微结构研究J动物学报,1995,4143413461919上官步敏,李少菁锯缘青蟹X器官神经分泌细胞的细胞学研究J海洋学报,1994,1661161212020蔡生力甲

30、壳动物内分泌学研究与展望J水产学报,1998,2221541612121阎斌伦,梁利国,张晓君三疣梭子蟹主要病害研究进展J水产科技情报,2010,12933,372222王建平,余晓巍,周志强,等宁波市三疣梭子蟹主要病害流行特征及应对措施J河北渔业,2008949532323赵鹏,徐继林,亓一舟,等高效液相色谱三重四级杆质谱分析海洋甲壳动物淋巴和肌肉中的20羟基蜕皮酮J分析化学，2011,39157612424LIMAYAVARAMBAN,DDHAYAPARAN,HALAGOWDERDEVARAJMOLECULARMECHANISMOFMOLTINHIBITINGHORMONEMIHINDUC

31、EDSUPPRESSIONOFECDYSTEROIDOGENESISINTHEYORGANOFMUDCRABSCYLLASERRATAJFEBSLETTERS,2007581516751722525CORNELIABUCHHOLZ,DIETERADELUNGTHEULTRASTRUCTURALBASISOFSTERIODPRODUCTIONINTHEYORGENANDTHEMANDDIBULARORGANOFTHECRABSHEMIGRAPSUSNUDUSDANAANDCARCINUSMAENASLJCELLTISSUERES,198020683942626JUNYINGZHENG,TERUA

32、KINAKATSUJI,ROBERTDROER,RDOUGLASWATSONSTUDIESOFARECEPTORGUANYLYLCYCLASECLONEDFROMYORGANSOFTHEBLUECRABCALLINECTESSAPIDUS,ANDITSPOSSIBLEFUNCTIONALLINKTOECDYSTEROIDOGENESISJGENERALANDCOMPARATIVEENDOCRINOLOGY,2008780788本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹蜕皮周期中蜕皮激素浓度的变化目录1引言12材料和方法121材料122主要仪器设备与试剂223实验方法2231标准溶液的配制3232色谱和

33、质谱条件UPLC条件3233标准曲线和检出限4234血淋巴蜕皮激素浓度的变化的测量43实验结果431检测获得的蜕皮激素浓度432数据分析结果54结论6致谢错误未定义书签。参考文献6附录错误未定义书签。摘要甲壳动物Y器YORGAN分泌的蜕皮类固醇激素对其蜕皮过程起重要调控作用。利用高效液相色谱电喷雾串联质谱（LCMS/MS）法完成三疣梭子蟹蜕皮过程中血淋巴蜕皮激素浓度变化的测定。随着蜕皮周期的运行基本处于逐渐升高的趋势，蜕皮后期A/B蜕皮激素的浓度较低，低于仪器检测限003NG/ML。进入蜕皮间期后，蜕皮激素的浓度开始逐渐恢复正常13930245NG/ML。进入蜕皮前期蜕皮激素浓度逐渐上升，D0

34、，D1，D2其浓度分别为45470372NG/ML，64060438NG/ML和81350423NG/ML；而在蜕皮前期D3期达到最高峰200711327NG/ML，D4有所回落变为103130511NG/ML。该研究结果证实蜕皮类固醇激素对三疣梭子蟹蜕皮过程起重要调控作用。关键词三疣梭子蟹；蜕皮周期；蜕皮激素；LCMS/MSABSTRACTCRUSTACEANYCONTROLYORGANSTEROIDHORMONESECRETEDBYTHEIRMOLTINGMOLTINGPROCESSPLAYSANIMPORTANTREGULATORYROLEHIGHPERFORMANCELIQUIDCHR

35、OMATOGRAPHYTANDEMMASSSPECTROMETRYLCMS/MSMETHODTOCOMPLETETHEPROCESSOFPORTUNUSTRITUBERCULATUSMOLTINGECDYSTEROIDHEMOLYMPHCONCENTRATIONDETERMINATIONWITHTHEMOLTCYCLE,RUNNINGBASICALLYATTHEINCREASINGTENDENCY,MOLTLATERA/BLOWCONCENTRATIONSOFECDYSONE,BELOWTHEINSTRUMENTDETECTIONLIMITOF003NG/MLINTOTHEINTERMOLTP

36、ERIOD,THECONCENTRATIONOFECDYSONEGRADUALLYRETURNEDTONORMAL13930245NG/MLINTOTHEPREMOLTECDYSTEROIDLEVELSINCREASEDGRADUALLY,D0,D1,D2CONCENTRATIONWERE45470372NG/ML,64060438NG/MLAND81350423NG/MLEARLYINTHEMOLTINGD3ACHIEVETHEHIGHEST200711327NG/ML,D4FELLBACKINTO103130511NG/MLITPROVEDSTEROIDHORMONEPLAYSANIMPO

37、RTANTREGULATORYROLETOPORTUNUSTRITUBERCULATUSKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUS；MOULTINGCYCLE；ECDYSONE；LCMS/MS272829301引言三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）属节肢动物门（ARTHROPODS）、甲壳纲（CRUSTACEA）、十足目（DECAPODA）、梭子蟹科（PORTUNIDAE），分布于我国辽东半岛、山东半岛到广东、广西的各海区以及日本、朝鲜、马来西亚群岛等海域，是一种大型海产经济蟹类。作为重要的大型经济蟹类，三疣梭子蟹肉质鲜美，营养丰富，食用价值高，不

38、仅是我国传统的名贵海鲜，也是一种重要的出口海产品。20世纪90年代中期开始，三疣梭子蟹的大规模育苗和养殖在我国逐渐推广，现今三疣梭子蟹已是世界上养殖规模最大的海洋经济蟹类之一。蜕皮激素是一种类固醇激素，它既存在于无脊椎动物（主要是节肢动物）中，也存在于植物中。甲壳动物蜕皮激素由Y器（又称为蜕皮腺，与昆虫的前胸腺为同功器官）合成、分泌1,2。目前国内已有人对甲壳动物蜕皮腺及蜕皮激素做了一些研究，如叶海辉等1采用组织切片和电镜技术，对锯缘青蟹大颚器、Y器的形态结构进行了观察，以及陆剑峰、赵维信3对中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSIS）Y器官在蜕皮周期中的超微结构，进而指出其对蜕皮过程的影

39、响。目前尚无人研究三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）的蜕皮周期，作为中国沿海重要的经济蟹类，刚蜕完壳的软壳蟹的体积比蜕壳前增加了3040,其壳通过环境中的钙盐等不断硬化而恢复正常硬度，三疣梭子蟹的个体增长在外表上并不连续，而是呈阶梯形，每蜕一次皮，上一个台阶。由此可见，三疣梭子蟹的生长发育与蜕皮息息相关，促进蜕皮的发生，可促进其发育成熟，提高产量。了解蜕皮发生的时间，周期的长短对促进沿海三疣梭子蟹养殖业的发展非常重要。节肢动物的蜕皮激素主要是指20羟基蜕皮酮（20E），有关研究多集中于它对人类和各种动物种类的促进生长作用方面。临床研究表明，20E可以很好地促进生物生理

40、代谢,而且不产生副作用。但甲壳类蜕皮激素浓度达到200400MG/L时，会出现外皮加厚等中毒现象。因此，应关注蜕皮激素在甲壳动物中的含量变化，水产养殖过程中应保证生物体内蜕皮激素含量处于合适的范围内4。1953年GABE首次描述了58种软甲亚纲（MALACOSTRACA）种类的Y器，而切甲亚纲（ENTOMOSTRACA）种类没有Y器5。Y器分泌的蜕皮类固醇不具生物活性，只有进入血淋巴，在外周组织20羟化酶的催化作用下才转化成具有生物活性的20羟蜕皮酮6。即是说Y器官产生A蜕皮酮，进入血液后转化为活性物质、实际的蜕皮激素是20羟蜕皮酮（蜕皮酮）。Y器官能从血液中吸收由食物中获得的胆固醇合成类固醇

41、激素。脊椎动物类固醇激素在血液中通常是与携带蛋白结合在一起运输的，而在甲壳动物血液中还未发现与类固醇激素结合的蛋白，至少95的此类激素是自由运行的。研究表明，20羟蜕皮酮不仅参与甲壳动物的蜕皮活动和胚胎发育，而且参与了卵巢发育过程7。如日本沼虾（MACROBRACHIUMNIPPONENSE）、中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSIS）、中国对虾（PENAEUSCHINENSIS）血淋巴中20羟蜕皮酮的周期性变化均与卵巢发育相关联810。蜕皮激素含量的多少，直接关系到虾蟹的存活和生长。含量太低，起不到促蜕皮、促生长作用；含量太高，会使虾蟹因蜕皮过频而缺乏正常生长所必需的营养，含量过高甚至

42、还会引起虾蟹类中毒从而出现虾蟹大面积死亡11。因此，对虾蟹蜕皮促长素以及同类药物中蜕皮激素的含量进行测定显得尤为必要。本文利用高效液相色谱电喷雾串联质谱（LCMS/MS）法完成三疣梭子蟹蜕皮过程中血淋巴蜕皮激素浓度变化的测定，对所得数据进行统计分析，为海洋甲壳动物蜕皮等生长发育过程的生理学研究提供参考。312材料和方法31121材料三疣梭子蟹自海中捕捞后在宁波宁海长街得水育苗场养殖池中暂养，雌雄各半。体宽在911CM之间，体重在4565G之间，放养在相同条件的育苗池内，海水盐度、水温以及水体溶解氧浓度、喂食量等相同，并且保证池内的梭子蟹都能正常生长发育，从而减小因为不同环境条件而造成的误差。本

43、实验用水为宁海县得水水产苗种场蟹苗池海水，该海水取自自然海区，经过几天的沉淀池暗沉淀和两次砂滤池过滤。海水进入育苗池后用增氧泵进行水体增氧，保证水体的溶解氧充足。实验样本均为未经过生殖蜕皮的三疣梭子蟹。31222主要仪器设备与试剂OLYMPUSCX21FS1显微镜；PPENDORFAG22331HAMBURY24500离心机；OPLENIC5818观测目镜；TSQQUANTUMACCESS液相色谱一三重四极杆质谱联用仪（THERMOFINNIGAN公司），配有ESI源；超纯水系统（法国MILLIPORE公司）；20羟基蜕皮酮和高油菜素内酯标准品（纯度98，美国SIGMAALDRICH公司）；乙

44、腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；纯水由超纯水系统制备；其他试剂均为国产分析纯，生物冰袋冰盒。31323实验方法蜕皮的整个过程包括蜕去旧甲壳，个体由于吸水迅速增大，然后新甲壳形成并硬化。因此甲壳动物的个体增长在外形上并不连续，呈阶梯形，每蜕一次皮，上一个台阶。参照传统甲壳动物蜕皮阶段的划分，结合三疣梭子蟹类本身所独有的特点，以游泳足末节新旧表皮间距/旧表皮厚度的比值为主要依据，将三疣梭子蟹蜕皮周期划分为蜕皮后期（A和B），蜕皮间期C，蜕皮前期（D0，D1，D2，D3和D4）以及蜕皮期（E）等四个阶段12。目前检测生物体内蜕皮激素的方法有薄层扫描法、放射免疫测定法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法

45、等13,14。液相色谱法和薄层扫描法灵敏度较低，而放射化学法无法进行精确定性分析，并且三疣梭子蟹抗原抗体的的制备比较繁琐。虽然国际上有更好的高效液相色谱三重四级杆质谱分析方法等，但针对于三疣梭子蟹本方法液相色谱质谱分析方法操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，已经应用于哺乳动物及昆虫体内蜕皮激素的痕量检测14。LC/MS的联用始于70年代，90年代以来，由于大气压电离的成功应用以及质谱本身的发展，液相色谱与质谱的联用，特别是与串联质谱（MSPMS）的联用得到了极大的重视和发展。LCMS/MS联用的优点非常显著，因为气相色谱只能分离易挥发且不分解的物质，而液相色谱则把分离范围大大拓宽了，生物大分子也

46、能分离，LC与高选择性、高灵敏度的MS/MS结合，可对复杂样品进行实时分析，即使在LC难分离的情况下，只要通过MS1及MS2对目标化合物进行中性碎片扫描，则可发现并突出混和物中的目标化合物,显著提高信噪比15。本实验采用电喷雾电离ESI接口，图1为ESI示意图。溶液中样品流出毛细管喷口后，在雾化气N2和强电场36KV作用下，溶液迅速雾化并产生高电荷液滴。随着液滴的挥发，电场增强,离子向液滴表面移动并从表面挥发，产生单电荷或多电荷离子。通常小分子得MH或MH单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测量的是质P荷比M/Z，可测定的生物大分子的质量数高达几十万。ESI是很软的电离，可直接测定

47、热不稳定的极性化合物，多电荷形成可分析蛋白质和DNA等生物大分子，调节离子源源内ID电压可以控制离子的断裂，给出结构信息。3131图1电喷雾电离示意图FIG1SCHEMATICDIAGRAMOFELECTROSPRAYIONIZATION3132231标准溶液的配制准确称取50MG20E标准品，以甲醇溶解并定容至10ML，配制成5G/L标准储备液，置4冰箱中保存。制作工作曲线时，用甲醇将此储备液稀释成不同浓度的标准溶液,每份标准溶液中加入高油菜素内酯，使其含量达到100MG/L。图220羟基蜕皮酮A和高油菜素内酯B的结构式FIG2STRUCTURESOF20HYDROXYECDYSONEAAN

48、D22S,23SHOMOBRASSINOLIDEB3133232色谱和质谱条件UPLC条件HYPERSILGOLDC18色谱柱100MM21MM17MM，美国THERMOFISHERSCIENTIFIC公司，进样量10M，柱温40，流动相为05乙酸A和乙腈B，流速02ML/MIN。梯度洗脱08MIN，10100B；810MIN，100B；1012MIN，10010B；1216MIN，10B。QTOFMS条件采用电喷雾电离源负离子电离模式，毛细管电离电压23KV，取样锥孔电压25V，离子源温度100，脱溶剂温度250，脱溶剂氮气流速400L/H，锥孔反吹氮气。四极杆扫描范围M/Z2001000，

49、碰撞室能量4V，TOF离子飞行方式采用V模式。分别提取M/Z4072和4372作为皮质醇和地塞米松定量目标离子，使用亮脑啡肽（M/Z5542615）作为外标物对目标离子进行精确质量锁定。QQQMS条件采用电喷雾电离源负离子电离模式，离子化条件与QTOFMS条件同。采用MRM多反应监测方式，皮质醇定量离子对M/Z4072/3314，碰撞能量L8V，定性辅助离子对M/Z4072/3615，碰撞能量L2V；地塞米松定量离子对M/Z4372/3615，碰撞能量L8V。各离子对驻留时间均为200MS14。3134233标准曲线和检出限3135分别配制含1，5，10，20和50MG/L20E及100MG/L高油菜素内酯的混合标准溶液,采用上述质朴条件进行LCMS分析。在050MG/L范围内线性方程式为Y08013X01768，相关系数R209978。由于甲壳动物蜕皮激素含量通常很低,均在相应的线性范围内，故采用此标准曲线对三疣梭子蟹血淋巴中的蜕皮激素进行定量分析。对10ML02MG/L20E标准样品进行分析，测得20EM/Z4812定量特征碎片离子M/Z4452的信噪比S/N18。将对应S/N3的标准样品量作为检出限,可算出本方法20E的检出限为003MG/L3。314234血淋巴蜕皮激