环境废物净化光合菌的筛选及其代谢特性初步研究【开题报告+文献综述+毕业设计】.Doc

1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程环境废物净化光合菌的筛选及其代谢特性初步研究一、选题的背景与意义光合细菌（PHOTOSYNTHETICBACTERIA,简称PSB），是一类能进行光合作用而不产生氧气的特殊生理类群的原核生物的总称，广泛分布在自然界的水田、湖泊、江河、海洋、活性污泥及土壤中。光合细菌为革兰氏阴性菌，不能产生芽孢，形态多样，主要有球状、杆状、螺旋状和卵圆形。现在已知的光合细菌共有着色杆菌科、外硫红螺菌科、紫色非硫细菌、绿色硫细菌、多细胞丝状率细菌、螺旋杆菌科、含细菌叶绿素的专性好氧菌等7大群共约50个属，而且不断有新种发现。在不同的自然条件下，光合细菌表现出不同的生理生化功能

2、，如固氮、固碳、脱氢、硫化物氧化等，在自然界的物质循环中其重要作用。光合细菌本身无毒，含有丰富的蛋白质、氨基酸、生物必需的维生素、抗病毒活性因子、辅酶Q10以及多种生理活性物质。这些微生物在其生长过程中能利用许多有机物，并能降解和利用化肥及农药产生的分泌物。它独特的代谢方式和代谢产物使其能广泛应用于环境污水处理、水产养殖、畜禽养殖和医药等应用领域，具有十分广阔的前景。随着社会的发展，人们对环境的污染增大，尤其是水环境，各种重金属污染，含氮含磷的有机物使水体富营养化、含硫化合物和亚硝酸盐等污染严重。而光合细菌在有机废水处理中显示出强力优势，且已被应用于近20种的有机废水的处理，有的已达工业化规模

3、，与传统活性污泥法相比，PSB处理法具有有机质负荷高、设备规模小，动力消耗低，占地面积小、脱氮除磷效果好，耐盐能力强、管理简单，产生的菌体可综合利用，不存在污泥处理问题、前期投资少，见效快等优点。因此利用PSB处理有机废水越来越受到人们重视。近年来，养殖业的发展带来了一系列问题，水质环境恶化，养殖病害加剧，消毒剂、化学药剂的大量使用带来的病菌抗药性和药物残留等问题。PSB以其独特的生化特性和营养功能，在水产养殖、畜禽生产、饲料添加剂等方面被广泛应用。在水产养殖方面，PSB不仅净化水质，改善养殖环境，还能直接作为鱼、虾、蟹等水产动物的饵料。在畜禽养殖方面，主要是作为饲料添加剂，提高畜禽的免疫力，

4、改善畜禽的肉质。随着人们对家畜和禽类的需求量增加，饲料的耗量也增加，成本上升，畜禽的粪便和污水排放也急剧增加。光合细菌已开始向此领域的应用扩展，但相关报道较少。本课题针对此情况，试图从自然界分离得到一株光合细菌，能够应用于畜禽粪便的处理，达到改善畜禽养殖环境、减少饲料耗量、改善肉质的目的。该光合细菌将主要应用于作为猪饲料的添加剂和改善养猪场的环境，降低成本，改善猪肉品质。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究内容1）从自然界中筛选分离得到一株光合细菌2）该光合细菌的代谢特性的初步探究拟解决的主要问题1）光合细菌的筛选分离2）该光合细菌的代谢特性三、研究的方法与技术路线研究方法1）光合细菌的筛

5、选分离A）样品的采集宁大林杏琴外池塘的池水和底泥B）初步富集纯化试管中厌氧培养C）划线分离双层平板法划线分离D）菌种鉴定并保藏2）该光合细菌代谢特性的初步探究A脱氮特性研究培养基氮源减少三分之二，外加02的KNO3，取对数生长期菌种10接入量，第2天开始测定，连续测6天。B脱硫特性研究培养基中按2G/L比例加入NA2S。分装试管10菌种接入量。测定同上。C脱磷特性研究空白对照，测定培养基中总磷量的变化，测定同上。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年9月至2010年10月1）资料的收集与文献阅读2）拟写试验研究提纲3）购置试验所需的仪器设备及药品试剂2010年11月至2011年2月1分离筛

6、选所需要的光合细菌菌株2光合细菌生长代谢特性的初探2011年2月至2011年4月1）数据整理与分析2）撰写总结与论文五、主要参考文献1陈培林光合细菌应用的研究进展J科技信息,2009,2271722宋志文,席俊秀,张锡义等一株光合细菌的分离筛选及对污水净化的净化效果J青岛建筑工程学院学报,2004,25445483李晓玲,金晓弟,张小民脱氮光合细菌的分离及其脱氮条件研究J山西大学学报,2002,254）3503534刘芳,王敏,杨慧等1株紫色非硫光合细菌的分离鉴定J安徽农业科学,2008,3618753875395陈坤,崔友勇,张娅婷等光合细菌和水浮莲在河南农村猪场污水中的应用J生态与农村环境

7、学报,2009,2531031056揭晶,赵越光合细菌应用的研究进展J广东药学院学报,2006,2211131157王红兵,廖望,管桂萍光合细菌在畜禽水产养殖业的应用J湖南畜牧兽医,2009,样品采集含硫有机物代谢特性研究含氮有机物代谢特性研究综合评价含磷有机物代谢特性研究保藏菌种鉴定厌氧富集划线分离筛选6468赵倩,谷巍等光合细菌生物学及其在水产养殖中的应用J河北渔业,20086789刘慧玲,张红莲,李细钊等光合细菌的分离及其对水体中亚硝酸盐降解的研究J水产科学,2005,246323310付军,郝博,董元彦几株光合细菌的分离鉴定及净水能力分析J湖北农业科学,2007,46339039211

8、金梅,唐湘华,刘磊等光合细菌对畜禽粪便中三种成分物质的降解作用J饲料工业,2010,3117202112刘昆,倪学勤,曾东光合细菌生产配方的优化研究J中国饲料,20089414313魏玉刚,邹宁,邱芳蕾光合细菌的几种培养方式的比较J安徽农业科学,2007,35299126912714王玲娜,李雪琼,张宏斌光合细菌的分离鉴定及其应用于水产饲料添加剂的研究J畜牧与饲料科学,200846915袁盈波,潘志崇,张德民一株光合细菌的分离及其硫化物的处理效果J宁波大学学报,2010,2321516程新,涂晓嵘,魏赛金一株光合细菌的分离鉴定及其处理污水能力的研究J安徽农业科学,2009,3710439143

9、9317邹文娟,许晓慧,王国武等光合细菌和枯草芽孢杆菌在污水处理中的应用J广东农业科学,2010919920118陶思源,李娜,赵新刚光合细菌PSBB4的分离与培养条件优化研究J沈阳师范大学学报,2010,281909319徐成斌,孟雪莲,马溪平等光合细菌的特性及其在产业中的应用J现代农业科技,20109111220张芳蕾,邱宏端,谢航光合细菌液态浓缩制剂的保藏研究J福建水产,20091374221韩磊,黄成彬,王春刚光合细菌在废水处理上的应用综述J潍坊高等职业教育,2008,41454822丁丹,胡忠策,金赞芳等光合细菌降解废水中对硝基苯酚的研究J安徽农业科学,2010,3819102191

10、0221,1038323YASUOASADA,MITSUTAKAOHSAWA,YUICHIRONAGAIREEVALUATIONOFHYDROGENPRODUCTIVITYFROMACETATEBYSOMEPHOTOSYNTHETICBACTERIAJINTERNATIONALJOURNALOFHYDROGENENERGY2008,33195147515024BORISF,BELOKOPYTOV,KESTUTISSTOWARDSTHEINTEFRATIONOFDARKANDPHOTOFERMENTATIVEWASTETREATMENTJINTERNATIONALJOURNALOFHYDROGE

11、NENERGY2009,3483324333225ASARTI,EPOZZI,FACHINALIATHEPERFORMANCEOFANANAEROBICSEQUENCINGBATCHBIOFILMREACTORTREATINGDOMESTICSEWAGECOLONIZEDBUANOXYGENICPHOTOTROPHICBACTERIAJCHEMOSPHERE2006,62914371443毕业论文文献综述食品科学与工程光合细菌的研究现状摘要本文简要介绍了光合细菌的分类、特性和应用，特别是在环保和养殖方面的应用，还初步介绍了光合细菌的分离筛选方法。关键词光合细菌；特性；应用；分离光合细菌PHOT

12、OSYNTHETICBACTERIA,PSB是一类能进行光合作用而不产氧的特殊生理类群的原核生物的总称，能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨氮等为营养进行生长和繁殖1。广泛存在于自然界的水田、湖泊、江河、海洋、活性污泥及土壤中。1光合细菌的分类光合细菌在分类上属于原核生物界PROCARYOTA、真细菌亚界PEUBACTERIA、薄壁菌门GRACILICUTES、红螺菌目RHODOSPIRLLALES和绿螺菌亚目CHLOROBINEAE。现在已知的光合细菌共分有着色杆菌科、螺旋杆菌科、紫色非硫细菌、绿色硫细菌、多细胞丝状绿细菌、螺旋杆菌科、含细菌叶绿素的专性好氧菌等7大群

13、共约50个属2，而且不断有新种发现。2光合细菌的特性和性质光合细菌为革兰氏阴性细菌，不能成芽孢，其形态非常多样，主要有球状、杆状、螺旋状和卵圆形，细胞直径大小为055M。主要以二分裂方式繁殖，少数出芽生殖。光合细菌因体内含有叶绿素和类胡萝卜素等色素，根据细菌所含色素的种类和数量不同，菌体呈现出不同的颜色。光合细菌能以光为能源，以CO2或有机物作为碳源繁殖，在不同的自然条件下具有不同的功能，如固氮、固碳、产氢等，在自然界物质循环中起重要作用。光合细菌菌体细胞除含有大量水分外，还含有20左右的干物质，包括蛋白质、碳水化合物、脂类和矿物盐等。此外，还含有丰富的维生素以及人体必需的多种氨基酸3。因此可

14、以作为饲料添加剂，广泛用于水产养殖和畜禽养殖。3光合细菌的应用因为光合细菌菌体含有丰富的蛋白质、氨基酸、生物必需的维生素、抗病毒活性因子等，能促进动植物生长，增强其抗病能力。它还可以通过光合作用，维持物质循环，降解废弃有毒物质，起到净化水质环境的作用，确保人类健康，所以已经引起人们高度重视，并在许多领域被广泛应用。31在废物处理方面应用光合细菌在厌氧光照、好氧光照或好氧黑暗条件下都能利用有机酸、氨基酸及糖类等小分子有机物迅速增殖，使废水得以净化。光合细菌能处理高浓度有机废水，具有适应性强、去除率高的效果。研究表明，光合细菌不仅能分解转化多种有机物，而且还耐受紫外线，对氯、盐分、及氰、酚毒物耐性

15、较强，可在恶劣条件下处理有机废水4。郑卓辉等5对光合细菌净水剂及光合细菌菌肥菜心杀虫剂残留物的降解情况进行了研究，发现光合细菌可使毒性残留期较长的三唑磷有效降解。艾翠玲6在传统的SBR反应器SEQUENCINGBATCHREACTOR中加入半软性填料，研究了光合细菌的两种代谢方式对味精废水化学需氧量COD的去除率的影响，并结合光合细菌的细胞结构特点和代谢方式讨论了其对活性污泥絮凝性能的影响。研究表明，黑暗系统中，处理味精废水活性污泥絮凝性能较光照系统中有较大提高，有机物去除率也有所提高。黄宝兴等7研究了固定化对光合细菌污水处理效果的影响，研究结果表明，使用海藻酸钠为基质的固定化海洋光合细菌和以

16、蒙脱石纳米材料为添加剂的固定化海洋光合细菌对生活污水中的氮、磷均具有一定的处理效率，相比没有固定化的处理率提高了10左右，12H左右即可提将处理率提高到6080。邹文娟等8则研究了光合细菌和枯草芽孢杆菌在污水处理中的应用，发现两种菌的混合菌在氮处理方面效果要比单一菌种好。李晓玲等9则对光合细菌的脱氮进行了研究，结果表明光合细菌以琥珀酸、丙酮酸、苹果酸、葡萄糖等为碳源，在厌氧条件下利用NO3和NO2作为电子受体，产生N2。光合细菌以其独特代谢特性的优势还被应用于畜禽养殖和水产加工废水的处理。金梅等10研究了光合细菌对畜禽粪便中三种成分物质的降解效果。研究显示光合细菌对氨态氮、磷、硫化物都有较好的

17、降解作用，可以进一步研究将其组合成试剂作为饲料添加剂应用。袁盈波等11也研究了光合细菌对硫化物的处理效果，结果显示光合细菌对畜禽废水和鱼粉废水中硫化物的去除有较好效果。32光合细菌在养殖业中的应用光合细菌没有毒性，且细胞中富含蛋白质和维生素，以及大量的类胡萝卜素和辅酶Q10等生理活性物质，对多种经济类养殖动物具有明显的促生长作用和预防疾病作用，营养价值很高。所以常作为饲料添加剂应用于养殖业。王志永等12研究了光合细菌对火烈鸟饲养的影响，结果显示光合细菌能保证火烈鸟的体色，并对火烈鸟有很好的保健作用。王玲娜等13研究了光合细菌作为水产饲料添加剂对养殖鱼的影响，结果表明光合细菌能明显提高养殖鱼的成

18、活率和生长速度。杨绍斌等14向培育草鱼的池塘投喂红螺菌科光合细菌，结果试验池比对照池成活率提高275，提高产量360KG/M2。杨鸢劫等15研究发现以轮虫25ML和25MG/L的光合细菌为开口投料投喂河魨，因增加了外源性的营养物质，结果河魨初孵仔鱼的成活率比只投喂轮虫的成活率提高12。值得注意的是，光合细菌相对缺乏W3系列的二十碳以上的高度不饱和脂肪酸，若单独作为鱼、虾、贝等幼体的初期饵料，最好与其他富含高度不饱和脂肪酸的饵料同时使用。33光合细菌在其他方面的应用光合细菌的色素无毒，易提取，色彩鲜艳，有光泽，可作为食品着色剂和添加剂，光合细菌富含类胡萝卜素，是天然色素的重要来源。蓝细菌、绿硫菌

19、与植物产生类胡萝卜素的原理相似16，都是将八氢番茄红素转变为番茄红素。我国在此方面的研究设计的菌种主要有球形红假单胞菌RPSPHAEROIDES和球形红杆菌（RHODOBACTERPHAEROIDES）17。光合细菌因为可分解有机物产氢，且产氢的能量转换率高，氢气纯度也高，而成为国际生物制氢的研究热点。国内，杨素萍等18详细阐述了固氮酶催化的光合产氢和氢酶催化的黑暗厌氧产氢机制。唐雅琴等19则综合介绍了光合细菌产氢的研究进展，对存在的问题进行了讨论，对应用前景进行了展望。国外，YASUOASADAD等重新评估了光合细菌利用醋酸盐产氢的情况，消耗每摩尔醋酸盐最高可产303摩尔的氢气20。光合细菌

20、还被用来制成保健食品。日本开发了光合细菌饮料。我国已经有人将光合细菌和其他益生菌以其制成了EMEFFECTIVEICROORGANISMS,有益微生物菌剂，EM菌剂有提高饲料转化率，降低成本；对疫病有奇特的防治效果；促进生长，缩短饲养时间等功效21。关于EM菌剂的研究正在兴起。4光合细菌的分离筛选方法41培养基富集培养基NH4CL10G，CH3COONA35G，MGCL201G,CACL201G，KH2PO406G，K2HPO404G，酵母膏01G，水1000ML，PH值72。半固体培养基KH2PO4033G，MGSO47H2O033G，NACL033G，NH4CL05G。CACL22H2O0

21、05G，丁二酸钠10G。酵母粉002G，琼脂6G，蒸馏水1L，PH值687222。42方法421菌株富集、分离和筛选方法将样品放入富集培养瓶中，注入富集培养液至液面距瓶口23CM，然后用液体石蜡密封，在30光照条件下厌氧培养23，直至培养液出现深红色，取少量红色培养液至新的富集培养液中培养，如此重复34次，然后取红色培养物用半固体培养基双层平板法划线分离，也可以采用试管稀释法分离单菌落24。422菌种鉴定根据分离菌株的细胞形态结构及生理生化特征，结合其培养特性，参照东秀珠等25的方法对菌种进行鉴定。5结语随着对光合细菌研究的深入，光合细菌在养殖业、环保、保健品、添加剂等产业中的应用越来越多。同

22、时对光合细菌的开发应用还多处在试验阶段，进行具体研究的仅限于少数几种光合细菌，投入生产的应用还是比较少。因此，需要科研人员深入研究，加快将其转变为生产技术的步伐，提高人们的生活质量和改善生存环境。参考文献1徐成斌,孟雪莲,马溪平光合细菌的特性及其在产业中的应用J现代农业科技,2010911122东秀珠,蔡妙英常见细菌系统鉴定手册M北京科学出版社,20013揭晶,赵越光合细菌的研究进展J广东药学院学报,2006,2211131154李彦芹,阚振荣,穆淑梅光合细菌研究进展J河北大学学报,2005,2555545595郑卓辉,梁文健光合细菌对菜心农药残留的降解效果J广东农业科学,2007776666

23、艾翠玲光合细菌对高浓度味精废水处理效果的影响J环境科学与管理,2008,33101231267黄宝兴,李兰生,赵亮等固定化海洋光合细菌处理生活污水的研究J海洋湖沼通报,2006269748邹文娟,许晓慧,王国武光合细菌和枯草芽孢杆菌在污水处理中的应用J广东农业科学,201091992019李晓玲,金晓弟,张小民脱氮光合细菌的分离及其脱氮条件研究J山西大学学报,2002,25435035310金梅,唐湘华,刘磊等光合细菌对畜禽粪便中三种成分物质的降解作用J饲料工业,2010,3117202111袁盈波,潘志崇,张德民一株光合细菌的分离及其硫化物的处理效果J宁波大学学报,2010,2321512王

24、志永,王万华,李勇军等螺旋藻和光合细菌在火烈鸟饲养中的应用的必要性J畜牧与饲料科学,2010,31813914013王玲娜,李雪琼,张宏斌等光合细菌的分离鉴定及其应用于水产饲料添加剂的研究J饲料添加剂,200846914杨绍斌,张永江光合细菌简易富集技术及在北方养鱼中的应用J水产养殖,2005,261222315杨鸢劫,杨辉微生物制剂在暗纹东方鲍养殖中的应用J水利渔业,2005,254828516FRGAARDNU,MARESCAJAYUNKERCE,ETALGENETICMANIPUPLATIONOFCAROTENOIDBIOSYNTHESISINTHEGREENSULFURBACTERIU

25、MCHLOROBIUMTEPIDUMJJBACTERIOL,2004,18616521017崔战利,陈锡时沼泽红假单胞菌类胡萝卜素的提取和组分分析J黑龙江八一农垦大学学报,2005,173418杨素萍,曲音波光合细菌生物制氢J现代工业,2003,2391719唐雅琴,黄兵,刘仪柯光合细菌微生物产氢研究进展J安徽农业科学,2009,37246646820YASUOASADA,MITSUTAKAOHSAWA,YUICHIRONAGAIREEVALUATIONOFHYDROGENPRODUCTIVITYFROMACETATEBYSOMEPHOTOSYNTHETICBACTERIAJINTERNATI

26、ONALJOURNALOFHYDROGENENERGY2008,33195147515021武迎红浅谈EM菌剂在养殖业中的应用J内蒙古民族大学学报,2006,124666722刘芳,王敏,杨慧等1株紫色非硫光合细菌的分离鉴定J安徽农业科学,2008,36187538753923程新,涂晓嵘,魏赛金等一株光合细菌的分离鉴定及其处理污水能力的研究J安徽农业科学,2009,37104391439324刘俊义,江文龙,李娟管和细菌菌落计数培养基的研究J微生物学杂志,2005,253182225东秀珠,蔡妙英常见细菌系统鉴定手册M北京科学出版社,2001本科毕业设计（20_届）环境废物净化光合菌的筛选及

27、其代谢特性初步研究目录1前言22材料与方法221实验材料2211实验试剂2212仪器设备3213培养基4214采集样品422实验方法4221光合细菌的富集、分离纯化及保存4222光合细菌代谢特性的初步研究43结果与讨论531菌株的分离纯化532三个光合细菌菌株的生长曲线533三株光合细菌对氮、磷、硫化合物代谢能力的初步探究5331培养基组分对三株光合菌（PSBS，PSBL，PSBH）生长的影响5332三个光合细菌菌株对PO43的代谢能力的定量分析6333三个光合细菌菌株对NA2S的代谢能力的定量分析7334三个光合细菌菌株对KNO3的代谢能力的定量分析84结论与建议9致谢错误未定义书签。参考文

28、献10附录错误未定义书签。摘要从自然界中分离一株光合细菌，对其代谢特性进行初步研究，为其在环境废物净化方面的应用奠定基础。采用厌氧培养法富集光合菌，半固体试管法和双层平板法划线分离单菌落，得到了PSBL、PSBH、PSBS三株光合细菌。通过在富集培养基中添加KH2PO4、NA2S和将氯化铵替换为KNO3进行培养来研究其对氮、磷、硫化合物的代谢能力。结果表明，在改动后的培养基中，三株光合菌都能生长；PSBL、PSBH、PSBS三株光合细菌培养4天后对磷酸盐的代谢率分别为1580、1349和1301；在培养了6天后，对硫化物的代谢率分别为4658、3288和3918；在培养了17天后，对硝酸盐的代

29、谢率分别为9638、8931和9004。关键词光合细菌；分离；代谢特性。ABSTRACTINORDERTOMAKEAFOUNDATIONOFDISPOSINGTHEENVIRONMENTALWASTEBYPHOTOSYNTHETICBACTERIA,THREEPHOTOSYNTHETICBACTERIAS,WHICHWERENAMEDPSBL、PSBH、PSBS,WEREISOLATEDFROMTHEENVIRONMENTANDTHEIRMETABOLICCHARACTERSWEREPRELIMINARYSTUDIEDTHESINGLECOLONIESWERESEPARATEDTHROUGHA

30、NAEROBICFERMENTATION,SEMISOLIDTUBEANDDOUBLELAYERPLATESANDTHEIRMETABOLICCHARACTERSWERESTUDIEDBYCULTUREDINTHEMEDIUMWHICHWEREADDEDKH2PO4、NA2SORREPLACEDNH4CLWITHKNO3ONTHEBASISOFENRICHMENTMEDIUM,RESPECTIVELYTHERESULTSSHOWEDTHATTHETHREEPHOTOSYNTHETICBACTERIAS,PSBL、PSBH、PSBS,WEREALLABLETOGROWINTHECHANGEDME

31、DIUM,ANDTHEMETABOLICRATEOFKH2PO4WERE1580、1349AND1301AFTER4DAYSCULTURED,THEMETABOLICRATEOFNA2SWERE4658、3288AND3918AFTER6DAYSCULTURED,THEMETABOLICRATEOFKNO3WERE9638、8931AND9004AFTER17DAYSCULTURED,RESPECTIVELYKEYWORDSPHOTOSYNTHETICBACTERIAISOLATIONMETABOLICCHARACTERS1前言光合细菌PHOTOSYNTHETICBACTERIA,PSB是一类

32、能进行光合作用但不产生氧气的特殊生理类群的原核生物的总称，广泛存在于自然界中，在水田、河流、池塘、海洋及土壤中都有分布。是地球上最古老的生物之一。光合细菌的生理类型很复杂，在不同环境下，有不同的代谢类型，能够代谢含有氮、磷、硫元素的化合物，在自然界物质循环中起重要作用1。光合细菌还具有产氢的特性，在解决能源危机方面很有前景，所以国外大部分学者都在研究光合菌产氢的特性，如YASUOASADA等2重新评价了一些能够利用醋酸作为碳源的光合菌产氢的能力，并与以乳酸作为碳源的菌株做比较。而国内的学者主要集中在废水处理的应用上，邹文娟等3研究了光合细菌和枯草芽孢杆菌在污水处理方面的效果，发现两种菌混合起来

33、能够很好的除去氨氮和活性磷酸盐。国外也有学者做此方面的研究，如KENJITAKENO等4对利用光合菌除去牡蛎养殖场底泥中分的含磷化合物进行了研究。光合细菌菌体富含蛋白质、氨基酸、辅酶Q及B族维生素等多种生理活性物质，能够提供生物体所必需的营养，增强其抗病能力5。但国内的研究大多放在水产养殖方面，赵倩等6阐述了光合细菌在水产养殖上的应用和注意事项。王志永等7研究了将光合细菌作为火烈鸟的饲料添加剂的效果，优化了火烈鸟的饲养方法，但火烈鸟主要栖息在有大片水域的地方。王玲娜等8研究了光合细菌作为鱼类饵料添加剂的效果，结果表明黑曲鱼添加光合菌的实验组比对照组成活率显著提高了20。近些年来畜禽养殖业不断发

34、展，相应带来了一系列的问题，畜禽养殖对饲料的需求增加，导致各种化学药物和激素的滥用，进而引发食品安全问题；畜禽养殖排泄物对环境的污染问题等等。光合细菌在畜禽养殖方面的应用也有研究，但报道较少。陈坤等9报道了光合细菌在处理农村猪场污水的效果，发现光合细菌与水浮莲共同作用，使污水的总氮量和总磷量分别下降了418和618。本文希望从自然界中分离几株光合细菌，筛选出一株对含有氮、磷、硫元素的化合物有较好代谢能力的菌株10，初步探究其净化环境方面的能力，为将来制作混合菌剂用于作畜禽养殖的饲料添加剂，提高饲料利用率，减少饲料消耗，降低成本，净化畜禽养殖环境奠定基础。2材料与方法21实验材料211实验试剂N

35、ACL、MGSO47H2O、CACL2、NH4CL、CH3COONA、KH2PO4、K2HPO4、KNO3、NA2S、AGNO3等均为分析纯，琼脂粉（杭州微生物试剂有限公司），酵母膏（国药集团化学试剂有限公司）。磷酸盐工作溶液（1ML含01MGPO43）称取在105干燥过的KH2PO41433G，溶于蒸馏水中稀释定容至1000ML，制成磷酸盐标准溶液，将磷酸盐标准溶液用蒸馏水稀释10倍，既得磷酸盐工作溶液。钼酸铵硫酸混合溶液于600ML蒸馏水中缓慢加入167ML浓硫酸（184G/ML），冷却至室温，称取20G钼酸铵NH46MO7O244H2O，研磨后溶于上述硫酸溶液中，用蒸馏水稀释至1000M

36、L。氯化亚锡甘油溶液（15G/L）称取15G优级纯氯化亚锡于烧杯中，加20ML浓盐酸（119G/ML），加热溶解后，再加80ML纯甘油（丙三醇），搅匀后转入塑料瓶中备用（密封保存，室温下不超过20天）。硫代硫酸钠标准溶液（01000MOL/L）称取25G硫代硫酸钠（NA2S2O35H2O）溶于煮沸放冷的蒸馏水中，加水至1000ML，加入04G氢氧化钠或02G无水碳酸钠，贮存在棕色瓶中。按下述方法标定浓度取碘酸钾（KIO3）在105烘烤1H，置于干燥器内冷却30MIN，用万分之一天平准确称取两份各015G，分别放于250ML碘量瓶中，各加100ML蒸馏水，待碘酸钾溶解后，各加3G碘化钾及10ML

37、冰乙酸，暗处静止10MIN，用待标定硫代硫酸钠溶液滴定，至溶液呈淡黄色时，加入1ML05淀粉溶液，继续滴定至蓝色退去为止，记录硫代硫酸钠溶液的用量，按A式计算硫代硫酸钠溶液的摩尔浓度。67351000VWMA式中M硫代硫酸钠溶液的摩尔浓度，MOL/L；W碘酸钾的重量，G；V硫代硫酸钠溶液的用量，ML。两次标定结果之间相差不得大于02。碘溶液（0005MOL/L）称取碘化钾40G，加蒸馏水25ML溶解，再加碘13G，搅拌使完全溶解，用蒸馏水稀释至1000ML，加3滴浓盐酸，盛于棕色瓶中，保存在暗处，此溶液稀释10倍，既得0005MOL/L的碘溶液。淀粉溶液（05）称取05G可溶性淀粉，用少量蒸馏

38、水调成糊状，用刚煮沸的蒸馏水稀释至100ML，冷却后加01G水杨酸或04G氯化锌。NA2CO3溶液（10G/L）。二磺酸酚溶液称取15G结晶酚（C6H5OH）于250ML锥形瓶中，加入105ML浓硫酸（184G/ML），放一短颈漏斗在瓶口，水浴加热，直至生成浅棕色稠状液，保存于棕色玻璃瓶中。乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液（20G/L）。氢氧化钾溶液C（KOH）10MOL/L。硝酸根标准溶液（100UG/ML）称取01631GKNO3与烧杯中，蒸馏水溶解后移入1000ML容量瓶总，稀释至刻度，摇匀。此溶液100ML含1000UG硝酸根。212仪器设备SLN电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司

39、TDL5台式低速大容量离心机，江苏金坛市医疗仪器厂LDZX40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂RXZ智能型人工气候箱，宁波江南仪器厂超级洁净工作台，上海淀山湖净化设备厂T6新锐可见分光光度计，上海普析通用仪器有限责任公司电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司213培养基富集培养基11,12乙酸钠30G，氯化铵10G，NACL10G，K2HPO405G，KH2PO405G，MGSO405G，CACL2005G，酵母膏20G，水1000ML，PH68半固体培养基在富集培养基的配方中添加1的琼脂。含硝酸盐的培养基13将富集培养基的氯化铵去掉，换成20G的KNO3。含磷酸盐的培养基

40、14在富集培养基中多添加20G的KH2PO4。含硫化物的培养基15在富集培养基的配方中添加20GNA2S。214采集样品从林杏琴会堂对面的水池采集样品1；从海运学院对面的水池采集样品2；从双桥的水沟采集样品3。22实验方法221光合细菌的富集、分离纯化及保存（1）光合细菌的富集16,17。以18MM180MM的试管作为厌氧培养容器，注入富集培养基，液面距离试管口留有2CM的空隙。取适量从环境中采集的样品（水与底泥）注入试管中，用液体石蜡密封，塞好橡皮塞，放到光照培养箱中在30下，光照强度20003000LX培养，直至培养液出现红色或棕红色，吸取1ML富集培养液到另一只盛有新鲜富集培养基的试管中

41、培养，重复上述操作45次，此时富集培养液中主要是光合细菌菌群。（2）光合细菌的半固体试管法分离纯化。取1ML光合细菌的富集培养液进行梯度稀释，分别取104、105、106、107等几个浓度（具体浓度梯度根据富集培养液的颜色深浅决定）菌悬液1ML接种于盛有融化状态的半固体培养基的试管中（培养基的温度以不烫手为准，太热会把光合菌烫死），在半固体培养基凝固前反复翻转，使光合细菌均匀的分布在半固体培养基中，然后放到光照培养箱中培养，直至试管中出现单菌落。（3）双层平板法纯化光合细菌。挑取试管中的单菌落在半固体培养基的平板上划线，再在上面倒一层半固体培养基，造成厌氧环境，用保鲜膜封口，放到光照培养箱中培

42、养。挑取单菌落镜检，达到菌株纯。（4）光合细菌的保藏。挑取菌株纯的单菌落用富集培养基培养，然后梯度稀释富集培养液按半固体试管法培养，待试管中出现单菌落后，将含有十几个到几个单菌落的试管放到冰箱中4保藏。222光合细菌代谢特性的初步研究（1）生长曲线的测定17。取三个菌株单菌落培养后的菌液1ML接种到新的100ML的富集培养基中，在光照培养箱中培养。每隔24H取样，用分光光度计在（T6新锐）于660NM处测定OD值，连续测定7天，按OD值与时间的关系绘制三株光合细菌的生长曲线。（2）光合细菌对氮、磷、硫化合物代谢实验。A定性试验10，含有氮、磷、硫化合物的培养基三种，每种培养基注入6支试管中，每

43、种培养基各有两支接种同一种光合菌，然后以富集培养基培养的三种光合菌作对照，培养7天后于660NM处测吸光值，比较其生长状况。B定量实验，分别向锥形瓶中注入含有氮、磷、硫化合物的培养基各100ML，然后分别接种三个菌株的对数期菌悬液10ML，以不接种光合菌的培养基做对照，放到光照培养箱中培养。（3）对培养基中氮、磷、硫化合物的残留量的测定。磷酸根的测定方法采用磷钼蓝比色法18。硫化物的测定方法采用碘量法19。硝酸根测定的方法采用二磺酸酚分光光度法20。3结果与讨论31菌株的分离纯化从三个地点采样，采用厌氧培养富集，双层平板法划线分离，得到三个菌株，分别命名为PSBL（从林杏琴会堂对面的水池采集的

44、样品1中分离得到）、PSBH（从海运学院对面的水池采集的样品2中分离得到）、PSBS（从双桥处得水沟采集的样品3中分离得到）。其中PSBL和PSBH菌株在光照厌氧条件下富集培养基菌液呈深红色，PSBS菌株的菌液在试管培养时有点偏橙黄色，锥形瓶培养时呈红色。镜检观察三个菌株的菌体都为卵圆形。32三个光合细菌菌株的生长曲线分别取PSBL、PSBH、PSBS三个菌株的菌悬液1ML接种到100ML新鲜的富集培养基中，在660NM测定吸光值，每隔24H测定一次，以OD值与培养时间的关系做三株光合细菌的生长曲线（见图1）。试验结果表明在48H左右时三个菌株都进入对数生长期，72H后细菌总量达到最大值，即进

45、入光合细菌生长的稳定期，此时菌体最多，代谢效率最高，适合观察三株光合菌对氮、磷、硫化合物的代谢能力，因此取培养72小时后的菌进行代谢活性的研究。图1三个光合菌株的生长曲线FIG1THEGROWTHCURVESOFTHETHREEPHOTOSYNTHETICBACTERIAS33三株光合细菌对氮、磷、硫化合物代谢能力的初步探究331培养基组分对三株光合菌（PSBS，PSBL，PSBH）生长的影响分别以盛有含硝酸盐的培养基、磷酸盐的培养基和硫化合物的培养基的试管作为实验组，以富集培养基作为对照组，分别接种三个光合细菌菌株富集培养72H后的菌悬液1ML，在厌氧、光照、30条件下培养10D，将菌悬液稀

46、释6倍，在660NM处测OD值，观察氮、磷、硫化合物对三株光合细菌生长的影响，结果如图2。图2结果表明，三个光合细菌菌株在含有氮、磷、硫化合物的培养基中都有生长，但氮、磷、硫化合物对不同的菌株的生长的影响是不同的。将培养基中的氮源完全替换为KNO3，对光合菌的生长有负面影响，三株菌的生长状况较对照组都减弱，其中PSBH菌株生长减弱的程度最大。而在富集培养基中添加2G/L的NA2S并没有对三株光合菌的生长产生负面影响，三株光合菌相对于富集培养基中的对照组，生长量都有不同程度的增加，其中PSBL增加的程度最大。当KH2PO4增加到25G/L时，刺激了三株光合菌的生长，与各自的对照组相比，PSBL的

47、生长量增加程度同样最大。根据三个菌株的生长受氮、磷、硫化合物影响的程度的不同，将PSBL列为重点观察菌株。图2培养基组分对三株光合菌生长的影响FIG2THEEFFECTIONOFTHEMEDIUMCOMPONENTSONTHEGROWTHOFTHETHREEPHOTOSYTHETICBACTERIAS332三个光合细菌菌株对PO43的代谢能力的定量分析磷酸盐标准曲线的制备。取10支具有磨口塞的25ML比色管，按表1配制各管溶液，混匀后于660NM处测其OD值，根据OD值与磷酸盐含量的关系绘制标准曲线（图3）。表1磷酸盐标准曲线的制作TAB1PREPARATIONOFSTANDARDCURVEO

48、FPHOSPHATE管号0123456789项目磷酸盐工作溶液/ML000010020040060080100150200250蒸馏水稀释/ML20202020202020202020钼酸铵硫酸混合溶液/ML25252525252525252525氯化亚锡甘油溶液/滴3333333333定容至/ML25252525252525252525在10个100ML的锥形瓶中各注入100ML含磷酸盐的培养基，取培养72H后的三个光合细菌的悬浮菌液各10ML分别接种3瓶作为实验组，留下一个不接种细菌的培养基作为对照，在厌氧、光照、30条件下培养4D，将发酵培养液离心（3000R，5MIN）过滤，取滤液稀释

49、400倍，用磷钼蓝比色法18测稀释后滤液中PO43的浓度，结果见表2。图3磷酸盐标准曲线FIG3THESTANDARDCURVEOFPHOSPHATE表2三个菌株对PO43的代谢能力TABLE2THEPO43METABOLICCAPACITYOFTHETREEPHOTOSYNTHETICBACTERIAS菌株起始PO43/MG/L4DPO43/MG/ML4D代谢率/实验组对照PSBH2402199723761349PSBL2402194323761580PSBS2402200823761301表2结果表明，三株光合细菌对磷酸盐都有较好的降解能力，而且三株光合菌的生长都明显加快，4天后PSBH、PSBL、PSBS对PO43的代谢率分别为1349、1580和1301，其中PSBL菌株的降解能力最强，为1580，与由图2得出的PSBL在磷酸盐增加时，生长增加的幅度最大的结论是相符的。333三个光合细菌菌株对NA2S的代谢能力的定量分析同样用对对PO43的代谢能力的定量分析的分组方法，将培养基换成含硫化物的培养基，在厌氧、光照、30条件下培养6天，应用碘量法测定NA2S的残留量，其中空白组是用水、滤纸与碘液混合，然后用NA2S2O3标准溶液滴定；实验组是用接种光合菌的培养液与碘液混合，然后用NA2S2O3溶液滴定；对照组是以不接种光合菌的培养基与碘液混合，