1、实验五 枯草杆菌蛋白酶酶活力测定一、实验目的1.加深了解酶活力的概念。2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。二、 实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解 1g 酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与 Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在 680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋
2、白酶的活力。三、 仪器和试剂仪器:恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。原料：枯草杆菌蛋白酶：称取 1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量 0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至 100mL，震荡 15 分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。试剂：1. Folin-酚试剂：（可以直接购买）在 2 L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na 2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na 2WoO4 . 2H2O)25g，蒸馏水 700mL，85%磷酸 50mL 以及浓盐酸 100mL，充分混匀后，微火回流加热 10 小时。再加入硫酸
3、锂 150g，蒸馏水 50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸 15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至 1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准 NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为 2mol/L)，然后加水稀释至 1mol/L，即可使用。2. 0.2mol/L 盐酸溶液3. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液4. 0.55mol/L 碳酸钠溶液5. 10%三氯乙酸溶液6. 0.02mol/LpH7.5 磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na 2HPO4 . 12H2O) 7.16g，用水定容至 100 mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na 2HPO4.
4、12H2O) 3.12g，用水定容至 100 mL (B 液)。取 A 液84mL，B 液 16mL 混合后，得到 0.2 mol/L pH 7.5 磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释 10 倍即可。7. 标准酪氨酸溶液(50g/mL)：称取 12.5 mg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2 mol/L 盐酸约 30 mL 溶解后，蒸馏水定容至 250 mL。8. 酪蛋白溶液 (0.5%)：称取 1.25 g 酪蛋白，用 0.04 mol/L 氢氧化钠溶液(20 mL)溶解，再用 0.02 mol/L pH 7.5 磷酸缓冲液定容到 250 mL。四、操作步骤(一)酪氨酸标准曲线的制作取 6 支
5、试管(标号 0，15) ，按顺序分别加入 0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和 1.00 mL 标准酪氨酸溶液，再用水补足到 1.00mL，摇匀后各加入 0.55 mol/L 碳酸钠 5.0 mL，摇匀。依次加入 Folin酚试剂 1.00 mL，摇匀并计时，于 30水浴锅中保温 15 min。然后 680 nm 处测定吸光值(以 0 号管作对照)。以酪氨酸含量(g) 作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。(二)酶活力测定1.酶反应：取一支试管，加入 2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，于 30水浴中预热 5 分钟，再加入 1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计时，水浴中准确
6、保温 10min，从水浴中取出后，立即加入 2.0mL 的 10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液(样品液)。另取一试管，先加入 1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和 2.0mL 的 10%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟，再加入 2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，然后于 30水浴保温 10min，同样干滤纸过滤，收集滤液(对照液) 。以上两过程，应各做一次平行实验。2.滤液中酪氨酸含量的测定取 3 支试管，分别加入 1.0 mL 水、A 液、B 液，然后各加入 5.0 mL 0.55 mol/L 碳酸钠溶液和 1.00 mL Folin-酚试剂，摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值，由标准曲线查出 A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。五、计算A 样品样品液的吸光度值A 对照对照液的吸光度值K标准曲线上 A=1 时对应的酪氨酸 g 数V酶促反应液的体积(本实验为 5mL)T酶促反应时间( 本实验为 10min)N酶溶液稀释倍数
