Southern northern western杂交应用.doc

1、分子杂交 分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小。根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、 Northern 杂交和 Western 杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。 一、 Southern blotting 1转膜 当目标 DNA 经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，在 0.4N NaOH 碱性条件下变性，再在 1.5M NaCl/1M Tris（ pH7.4） 条件下中和使 DNA 仍保持单链状态。然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的 DNA 转移到硝酸

2、纤维素滤膜或尼龙膜上。最后通过 80 处理或紫外线照射将 DNA 固定在滤膜上。图 4-2 是通过毛细管渗吸法进行 Southern blotting 的经典装置图。 2分子杂交 2.1 预杂交 将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。 2.2 杂交 在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的 DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。 2.3 洗膜 经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。 3检测 3.1 放射性标记、

3、检测 在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记 物主要是放射性同位素，如32P， 33P 和 35S 。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的 位磷酸整合到核酸链中，因此使用 位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如 - 32 PdATP 。而在标记 5 末端磷酸基团的反应中一般使用 位磷酸被标记的 ATP 。放射性的信号通过 X- 光片放射自显影或磷屏扫描获取。 3.2 非放射性标记、检测。 其中应用最成功的是原德国宝灵曼公司开发的地高辛 （ digoxygenin, DIG） 标记核酸探针。将 DIG 与 dUTP 交联，在参入核苷酸的标 记反应中用 DIG-11-dUTP （或 DIG-11-

4、UTP）取代 dTTP （或 rTTP），使探针 DNA 或 RNA 分子被 DIG 标记。 DIG 标记的检测是该技术的核心，即利用抗 DIG 的抗体通过酶联免疫反应来完成。将抗 DIG 的抗体与碱性磷酸酶偶联，通过免疫反应将碱性磷酸酶携带到目标核酸分子处，在加入显色剂 BCIP/NBT（ 5-溴 -4-氯 -3-吲哚磷酸盐 / 盐酸氮蓝四唑） 后碱性磷酸酶与显色剂反应形成浓紫色偏棕色沉淀，从而显示出目标分子的有无和位置。图 4-3 是通过地高辛标记探针 的 Southern 杂交实例。 M，地高辛（ DIG）标记的分子量标准（ lDNA/ Hind ）； 1-3，苏云金芽胞杆菌 YBT-1

5、520 菌株的总 DNA 分别经 Kpn Pst 、 Pst 和 Kpn 酶切。以 cry1Aa 杀虫晶体蛋白基因中的 728bp 片段作探针，通 过随机引物标记的方式，用 DIG 标记探针。结果显示，该菌株至少含有两个杀虫晶体蛋白基因，而且其拷贝数明显不同。预示至少其中一个基因位于多拷贝的质粒上。 图 4-3 ：通过地高辛标记探针的 Southern 杂交结果 通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的 DNA 分子及其分子量。 Southern 杂交主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。应用该技术的前提是必须要有探针。 4探针的

6、标记 在一 个核酸样品中查找是否存在某一特定序列的分子可用分子杂交来检测，但首先要有一段与目标核酸分子的序列同源的核酸片段。将该片段标记后与样品核酸进行分子杂交，通过检测标记核酸的存在从而判断样品中特定核酸片段的存在。用作检测的核酸片段即为探针 （ probe） 。 4.1 均匀标记 间接标记不是标记探针分子本身，而是复制一段新的探针分子，在复制过程中掺入标记的核苷酸（如 - 32 PdATP），从而使整个新分子被均匀地标记。 4.1.1 切口平移标记 这种标记方式目前只有通过大肠杆菌 DNA 聚合酶 来完成，只有该酶具有 5-3 外切活性。通过在待标记的 DNA 分子上产生切口，该酶引发 5

7、-3 外切反应，在随后的 5-3 DNA 聚合反应中若存在标记的脱氧三磷酸核苷酸 （ dNTP），新合成的核酸链就带有标记物。在整个标记反应体系中，待标记的 DNA 分子的任何一条链中的任何位点（除靠近 5 端外）都可能作为标记反应的起始点，并持续到该链的 3 末端。因此，新合成的被标记的分子可以代表该待标记的 DNA 分子的绝大部分核苷酸序列。 4.1.2 随机引物标记 利用由 6 个核苷酸组成的序列随机的寡核苷酸为引物，在 Klenow 酶的作用下对目标 DNA 进行随机扩增。这样扩增出来的 DNA 产物包括从任意某个位点 （可能最靠近 5 的一些核苷酸除外） 起始的单链 DNA 片段，其

8、整体应该包含了目标 DNA 所有核苷酸序列信息。在扩增中加入标记的 dNTP ，扩增出来的 DNA 产物就可用作探针。该方法多用来标记一个 DNA 片段。 4.1.3 PCR 扩增标记 在 PCR 扩增时加入标记的 dNTP ，不仅能对探针 DNA 进行标记还可进行大量扩增 ，尤其适合于探针 DNA 浓度很低的情形。 4.2 单链探针 4.2.1 单链 DNA 探针 单链 DNA 探针是通过单链模板来制备的。首先将待标记的双链 DNA 连接到 M13 噬菌体载体或噬菌粒载体上，制备其单链 DNA , 然后以单链 DNA 为模板，以对应于载体上插入位点两端序列之一的通用引物为引物，在有标记的 d

9、NTP 存在下，通过 Klenow DNA 聚合酶合成单链 DNA 。经过分离纯化后即可得到高质量的带标记的单链 DNA 探针。 4.2.2 单链 RNA 探针 在有些质粒载体的多克隆位点两端带有噬菌体的启动子，例如 pGEM-3 和 pBluescript 系列载体分别含有 T7/SP6 噬菌体启动子和 T7/T3 噬菌体启动子。将待标记的 DNA 片段插入载体的多克隆位点，在转录区下游选择一个酶切位点，用限制性内切酶将载体线性化以防止转录出载体的序列和多联体产物。加入对应的噬菌体 RNA 聚合酶， rNTP 和某个标记的 rNTP 在体外进行转录，合成出标记的单链 RNA 。利用无 RNA

10、 酶活性的 DNA 酶处理以及后续纯化步骤可获得纯化的单链 RNA 探针。单链 RNA 探针的制备不仅比单链 DNA 探针更容易，而且其产生的杂交信号更强。 4.3 末端标记 直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子，或直接在探针分子上加入标记的原子或复合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进行标记，亦称末端标。 4.3.1 DNA 片段的末端标记 末端标记主要通过酶促反应来完成，但标记的方式很多。如 Klenow DNA 聚合酶和 T4 或 T7 DNA 聚合酶在对 DNA 片段进行末端补平反应或平末端的置换反应时可引入标记的核苷酸， T4 多核苷酸激酶可在 DNA 的 5 末端引入

11、标记的磷酸基团或将 5 末端的磷酸基团用标记的磷酸基团置换，末端转移酶可在 DNA 的 3 末端连接标记的核苷酸。 4.3.2 寡核苷酸的标记 合成的寡核苷酸主要通过 T4 多核苷酸激酶在 5 末端引入标记的磷酸基团进行标记，也可利用末端转移酶在 3 末端连接标记的核苷酸。 二、原位杂交 原位杂交就是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来，并使之固定在滤膜上。然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的 DNA 。菌落杂交主要用来从用质粒或 Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆子，当得到阳性克隆子后，再通

12、过 Southern 杂交进一步验证。通过这种方法在一张直径为 9cm 的滤膜上，可检测成几百到一千甚至上万个菌落，达到高通量筛选的目的。 三、斑点杂交 斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将 DNA 或 RNA 分子以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。其杂交的信号比菌落杂交和噬菌斑杂交受到蛋白质 等细胞成分的干扰小，其结果的可靠性更强。当核酸分子的斑点面积变得更小，在单位面积滤膜上处理的样品数量就更多，当检测的灵敏度进一步提高后，就发展成 DNA 芯片。 四、 Northern blot Northern 杂交的总体过程与 Southern 杂交相似，只不过在 Blotting 过

13、程中转移的是 RNA 而不是 DNA ,这种将 RNA 样品从凝胶转移滤膜的方法，其设计者为之起了一个与 Southern blotting 对应的名称， Northern blotting 。其后的分子杂交过程 与 Southern 杂交过程中的分子杂交方式是一样的。 Northern 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的 mRNA 分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。 五、 Western blot Western 杂交的总体过程也与 Southern 杂交相似，只不过在 Blotting 过程中转移的是蛋

14、白质而不是 DNA ，这种将蛋白质样品从 SDS-PAGE 凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为 Western blotting 。其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交，而是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质，并判断其分子量。所用的探针不是 DNA 或 RNA， 而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。 Western 杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显示出目标蛋白。

15、六、蛋白质 N 末端序列测定 七、 RNA 端点分析 1 RNA 的 S1 核酸酶作图 对 mRNA 的端点进行分析之前必须知道 mRNA 的核苷酸序列，也就是必须获得该基因的核苷酸序列。首先预先判断 mRNA 的端点位置，设计一段覆盖该端点的寡核苷酸，并作末端放射性标记。然后将该标记的寡核苷酸与 mRNA 混合，退火，形成杂交体。在 S1 核酸酶作用下，呈单链状态的 DNA 和 RNA 被降解，保留 DNA-RNA 杂交体双链，最后通过凝胶电泳检测 DNA-RNA 杂交体中标记的 DNA 单链的分子量大小，从而 推断 mRNA 的末端序列。其工作原理见图 4-4 。这种方法既可以分析 mRNA 的 5 端也可分析 3 端。 2引物延伸法分析 mRNA 的端点 引物延伸（ primer extension）法主要用于 mRNA 的 5 末端作图，先要知道该基因的核苷酸序列并预先判断 mRNA 的端点位置。首先在 mRNA 的预测的 5 末端下游约 150bp 位置处，设计一段互补寡核苷酸引物。以 mRNA 作模板，用反转录酶延伸该引物，产生的 cDNA 与 mRNA 模板互补且其长度与引物 5 末端至 mRNA 的 5 末端之间的距离相等。