大黄鱼嗅觉上皮细胞免疫荧光标记研究【毕业设计】.doc

1、本科毕业设计（20_届）大黄鱼嗅觉上皮细胞免疫荧光标记研究所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录中英文摘要1引言12材料与方法221样品采集222实验试剂223实验设备324试验方法3241试剂制备3242样品的固定3243冰冻切片3244免疫组化反应4245荧光显微镜拍照43结果531GOLF/S的免疫组化反应532GO的免疫反应性633GQ/11的免疫反应性734在DAPI染色下，观察细胞核分布74讨论8致谢错误未定义书签。参考文献65附录错误未定义书签。摘要鱼的嗅觉上皮包含三种不同类型的嗅觉受体神经元（ORNS）分别为纤毛嗅觉受体神经元，微绒毛嗅觉受体神经元和隐

2、窝嗅觉受体神经元。由于嗅觉受体是G蛋白耦合受体，故本研究通过测试，以及免疫荧光的方法对大黄鱼这种我国特有的海洋经济鱼类的嗅觉神经元进行G蛋白检测，观察三类G蛋白在大黄鱼嗅觉神经元细胞中的分布情况。结果表明从浙江省宁波市象山县西沪港采样的大黄鱼的嗅觉上皮组织中存在着以下三种G蛋白分别为GOLF/S；GO；GQ/11。并且与这些ORNS的形态与细胞类型相对应。即，GOLF/S存在于纤毛ORNS的细胞膜中。GO大部分存在于隐窝ORNS细胞质中，少量存在于微绒毛ORNS中。GQ/11存在于微绒毛ORNS细胞表面。并通过与鲶鱼嗅觉上皮组织中G蛋白的对比与比较分析，得出在大黄鱼嗅觉上皮中存在着与鲶鱼嗅觉上

3、皮组织中相同的G蛋白，并发挥相似的功能。该实验所反映了大黄鱼嗅觉神经元细胞的内部结构与特点，对大黄鱼摄食生理学的深入研究提供理论基础。关键词嗅觉系统；嗅觉受体；G蛋白；免疫组化反映ABSTRACTFISHOLFACTORYEPITHELIUMCONTAINSTHREEDIFFERENTTYPESOFOLFACTORYRECEPTORNEURONSORNSARECILIATEDOLFACTORYRECEPTORNEURONS,OLFACTORYRECEPTORNEURONSOFMICROVILLIANDCRYPTOLFACTORYRECEPTORNEURONSTHEOLFACTORYRECEPT

4、ORSAREGPROTEINCOUPLEDRECEPTORS,THISSTUDYTESTED,ANDTHEMETHODOFIMMUNOFLUORESCENCETHATLARGEYELLOWCROAKERFISH,MARINEECONOMYOFCHINASPECIFICNEURONSINTHEOLFACTORYGPROTEINDETECTION,OBSERVEDTHREETYPESOFGPROTEININOLFACTORYNEURONSINFISHDISTRIBUTIONTHERESULTSSHOWEDTHATXIANGSHANCOUNTY,NINGBOCITY,ZHEJIANGPROVINCE

5、,SAMPLEDTHEOLFACTORYEPITHELIUMOFLARGEYELLOWCROAKERTHEREAREABOUTTHREETYPESOFGPROTEINS,RESPECTIVELYGOLF/SGOGQ/11ANDMORPHOLOGYOFTHESEORNSCORRESPONDINGCELLTYPESTHATIS,GOLF/SPRESENTINTHEPLASMAMEMBRANEINCILIATEDORNSGOCRYPTORNSPRESENTINMOSTOFTHECYTOPLASM,ASMALLAMOUNTPRESENTINTHEMICROVILLIOFORNSGQ/11ORNSPRE

6、SENTINTHECELLSURFACEMICROVILLIANDWITHTHECATFISHOLFACTORYEPITHELIUMINCONTRASTTOGPROTEINSANDCOMPARATIVEANALYSIS,THELARGEYELLOWCROAKERINTHEEXISTENCEOFOLFACTORYEPITHELIUMANDOLFACTORYEPITHELIUMOFCATFISHINTHESAMEGPROTEINS,ANDPLAYASIMILARFUNCTIONTHEEXPERIMENTREFLECTSTHELARGEYELLOWCROAKERBYOLFACTORYNEURONSI

7、NTHEINTERNALSTRUCTUREANDCHARACTERISTICSOFFISHFEEDINGONTHELARGEDEPTHSTUDYOFPHYSIOLOGYTOPROVIDEATHEORETICALBASISKEYWORDSOLFACTORYSYSTEM；OLFACTORYRECEPTOR；GPROTEIN；IMMUNOHISTOCHEMISTRY11引言自然界中存在大量的气味成分，为什么动物能感受到这些气味呢为了揭示这个秘密，很多研究者已经开对嗅觉系统进行系统地研究，包括从哺乳动物到鱼类，都做了大量的研究。脊椎动物的周边嗅觉系统由通过第一脑神经到嗅球OB传递信息的双极嗅觉受体神经

8、元（ORNS）支配。ORNS既可以是纤毛也可以是微绒毛的1。在许多陆栖脊椎动物中，其中包括蛇和啮齿类动物，嗅觉受体神经元（ORNS）被隔离成两个分开的隔间微绒毛嗅觉受体神经元在犁鼻器VNO上，而纤毛嗅觉受体神经元（ORNS）主要填充嗅觉上皮细胞OE。在解剖学水平上2分子3，及其功能的研究4表明嗅觉受体神经元（ORNS）到OB和附属OB是一种气味筹划，也就是说，不同类ORNS对潜在的味道的特定的分子特征做出最佳反应以及设计有限数目的小球。此外，在啮齿类动物中，受体细胞的类型包括纤毛和微绒毛，与在感觉传递中使用的受体分子的特定类型和G蛋白有一一对应的关系。主要的OE纤毛嗅觉受体神经元（ORNS）使

9、用OR型受体5，这种受体耦合G蛋白GOLF6和主要OB。根据所需的G蛋白（GO与GI，VNO的微绒毛受体细胞分为两个级别并包括附属OB的不同位置7。最近的一项研究报道，GQ也被表达在啮齿动物的VNO中8。在缺乏一个VNO的脊椎动物，例如，鱼、鸟、猿猴、类人猿和人类中，微绒毛和纤毛嗅觉受体神经元（ORNS）都有相同的OE，诸如鱼9；鸟，猿猴、猿10；人类11。因为这些物种也缺乏一个附属OB，两者的受体细胞类型表达主要OB。此外，鱼的OE含有不是特别丰富的嗅觉受体神经元（ORNS）的第三种类型隐窝受体细胞12。虽然嗅觉受体神经元（ORNS）的这三个类型混合在一个OE里，但是OB里气温主题的代表的概

10、念也能从鱼中获得13。最新的研究结果表明，在解剖和生理功能方面，鱼的嗅觉系统是由三个平行的经由嗅球到达端脑的神经通路组成的。这里有三种形态类型的神经元看似重叠的分布在嗅上皮上。每一种感觉神经元的轴突都汇集到一个特定的嗅球区域并且与独立的中继神经元相联系。每一个中继神经元的轴突离开嗅球并且到达端脑每一个嗅球表达了不同的信息，从而引发了对于日常生活中不同气味的不同特征的反应。这三个通路分别关系到社会行为，性行为以及捕食行为。每个感觉神经元只表达一个特定气味受体，似乎随机分布在神经上皮。然而，他们有组织的以一种固定的方法将轴突发送到嗅球。由于感觉神经元在形态和延髓反映上的不同，这是合理的假设，它们不

11、同还在于G蛋白的表达和气味受体分子。这一概念已被许多研究证实了的，揭露出了感觉神经元形态学的相互关系，例如气味受体分子的类型和G蛋白表达。因此，纤毛神经元表达OR类型的味觉受体和GOLF/S14。转导途径是环核苷酸途径1516。微绒毛神经元表达V2R类型的气味受体和GAO，GAQ以及GAI314以及瞬时受体可能是C2途径（TRPC2）17。隐窝细胞表达GO和GQ转导蛋白14。在对于鲶鱼的研究中阐明了一个鱼类嗅觉系统中的显著区别。有三种类型的感觉神经元，每一种都有着与其相匹配的受体以及G蛋白，并表明了不同的传导机制。这些感觉神经元在上皮看似随意的分布，但每一类感觉神经元都可以产生对突触和神经嗅球

12、的刺激。有趣的是，到端脑的部分又分为三束并且联系到日常生活的调节信息，即饲养，繁殖和报警。在这样的系统中传递信息是与繁殖行为相关的，在雌性鲫鱼中有一种传递神经只与其四种性行为中的一种相关。这种现象不会在雄性的嗅觉系统中出现。这是一个关于在端脑中信息是如何被处理并且如何开始与嗅束上的嗅球进行神经联系的研究。端脑的神经生理记录表明了在端脑中不同气味的空间反射18。进一步的研究将解释不同的有关于发展与繁殖循环的气味信息是如何进行改变的。2具不同形态类型的感觉神经元似乎是利用了不同的气味受体和传导机制。这些最近的研究证实，每一个不同形态类型的感觉神经元表达了一类特定的的气味受体。因为这些感觉神经元随机

13、分布在嗅上皮，人们可以想想象一个在外围的非空间的化学拓扑结构。当它们进入感觉神经元的的嗅球轴突表达了特定的受体并以一个受体一个嗅球的方式结合了单一的嗅球。这样的组织与在昆虫嗅觉系统中发现的相同19。这种的隐窝细胞外观的变化20会引发许多问题，例如，每个个体荷尔蒙状态对感觉神经元的表达以及气味受体的影响，包括对不同气味的敏感度，从而对行为反应和物种生态造成一定的影响。鱼会对各种级别的嗅觉刺激产生反应氨基酸、核苷酸、胆汁盐和外激素2125。其中前两个通常是食物饲料刺激，然而后两个则与社会互动有关。一种特定类型的ORN是否一定被一特定级别的刺激激活可能因为鱼的不同种类而有所不同。大黄鱼是我国特有的经

14、济鱼类，属于海洋性鱼类，本研究通过免疫荧光的方法对大黄鱼的嗅觉神经元进行G蛋白检测，观察三类G蛋白在大黄鱼嗅觉神经元细胞中的分布情况。了解大黄鱼嗅觉神经元细胞的内部结构与特点，从而对大黄鱼摄食生理学提供理论基础。本实验通过对鱼类嗅觉器官尤其是大黄鱼嗅觉器官的解剖及观察，并通过免疫荧光标记法检测大黄鱼的嗅觉神经元中是否含有与以下三类嗅觉神经元纤毛嗅觉神经元、微绒毛嗅觉神经元、隐窝嗅觉神经，有关的气味受体及G蛋白。鱼的嗅觉上皮包含三种不同类型的嗅觉受体神经元（ORNS）分别是纤毛嗅觉受体神经元（ORNS），微绒毛嗅觉受体神经元（ORNS）的和隐窝嗅觉受体神经元（ORNS）。本实验进行了测试，观察嗅

15、觉受体神经元（ORNS）的不同类型是否会对通过受体分子和G蛋白的不同种类对不同类别的气味作出的不同反应。为了检验关于大黄鱼的这个假说，我们设计了如下实验来进行科学探索。2材料与方法21样品采集12条大黄鱼采集于浙江省宁波市象山县西沪港，从鱼的鼻子中解剖出嗅觉器官于4多聚甲醛固定于试管中。22实验试剂（1）4多聚甲醛溶液称取40G多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500800ML01MOL/L磷酸缓冲液，加热至60左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，最后补足01MOL/L的磷酸缓冲液于1000ML，充分混匀。（2）PBST溶液PBS缓冲液（PH7274）NACL137MMOL/L，KCL27

16、MMOL/L，NA2HPO443MMOL/L，KH2PO414MMOL/L，015曲通X100。（3）琼脂糖蔗糖溶液将15G琼脂糖加入30蔗糖溶于100MLPBST微波炉加热溶解。（4）OCT冷冻包埋剂，购自于樱花SAKURA公司（美国），用于组织快速切片时的冷冻包埋（5）封闭液山羊血清（6）一抗兔抗鼠GOLF/S；GAO；GAQ/11购自于SANTACRUZ公司（美国）（7）二抗羊抗兔带FIFC荧光GOLF/S；GAO；GAQ/11，购自于SANTACRUZ公司（美国）3（8）DAPI4,6联脒2苯基吲哚，细胞核负染剂。是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜一起观测使用。因为

17、DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。（9）松柏油在油镜使用过程中所需23实验设备（1）4冰箱（2）水平摇床沃德生物医药公司，WD9405B（3）冷冻切片机德国美康公司，HM525（4）荧光显微镜OLYMPUSBX60（5）超净工作台（6）培养皿若干，容量瓶，烧瓶，镊子，24试验方法241试剂制备（1）GOLF/S在免疫荧光反应当过程中，将抗体在山羊血清当中稀释为1500，整个操作过程在超净工作台中完成。（2）GO在免疫荧光反应当过程中，将抗体在山羊血清当中稀释为1500，整个操作过程在超净工作台中完成。（3）GQ/11在免疫荧光反应当过程中，将抗体在山羊血清当中稀释

18、为1500，整个操作过程在超净工作台中完成。（4）DAPI溶解于两倍的去离子水（DISTH2O）中，最终浓缩为15MG/ML。在整个过程中不使用任何缓冲剂。242样品的固定（1）4的多聚甲醛对已采集的嗅觉器官进行固定后，用冷冻包埋剂包埋。（2）固定的组织用PBST洗涤，水平摇床（WD9405B）低速摇10分钟。（3）重复上一步操作一次。（3）将洗涤后的组织置于含15琼脂，30蔗糖溶液中（无菌），放置室温冷却使溶液凝固。而后削薄外围琼脂层，整理出规则形状。（4）将塑好形状的组织放置于用3的制糖溶液中，于PBST缓冲液在4环境中平衡过夜。（5）用OCT将组织包埋在模具中。（6）次日准备冰冻切片。2

19、43冰冻切片（1）将冰冻切片机预冷到零下20保持。（2）取材，将已经固定好的组织在模具中取出，放平摆好组织在支撑器上，并在组织滴加包埋剂，速4放于冷冻台上，冰冻。（3）将冷冻好的组织块夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮将组织修平。（4）调好欲切的厚度（510M）。（5）调节防卷板。（6）将切好的组织薄片吸附在玻片上，置于冰盒中，备用。244免疫组化反应（1）将切片在室温中放置5分钟。（2）将切片置于盛有PBST溶液（无菌）的培养皿中，水平摇床低速摇10分钟。（3）吸干组织周围多余水分用疏水笔在玻片四周画框。（4）滴入封闭液，用封闭液（山羊血清）封闭40分钟。（5）将一抗稀释于封闭液当

20、中，一抗孵育105分钟（室温下）。（6）将切片置于盛有PBST（无菌）溶液的培养皿中，低速水平摇床摇5分钟，洗涤。（7）重复以上步骤2次。（8）洗涤之后的组织加入二抗（1400稀释于封闭液中，避光保存）。（9）将切片置于盛有PBST（无菌）溶液的培养皿中，低速水平摇床摇5分钟，避光洗涤。（10）加入染色剂DAPI，染色30分钟245荧光显微镜拍照在荧光显微镜OLYMPUSBX60下观察，分别在10倍，40倍，100倍，以及油镜下观察结果。并分别在蓝色荧光与绿色荧光下面观察不同结果，并拍照。操作不走如下（1）开机打开电脑电源开关，打开数码相机电源开关，打开显微镜电源开关打开汞灯电源开关。（2）调

21、试显微镜光路把载玻片放到载物台上，调节聚焦。根据物镜指数乘08确定聚光镜光圈值，调整到位。将视场光阑缩小，然后调节聚光镜高度，直到从目镜中观察到视场光阑的清晰成像。放大视场光阑，使其在目镜中的黑框扩展到视野以外。（3）调试数码相机拍摄照片在显微镜取景器中对好视野及焦距。打开PHOTOSHOP程序。点击文件自动KODAKMDS290ACQUINE。调出相机控制窗口。ZOOM定为77。拍摄图片格式为640480不要改变。在相机控制窗口上点PREVIEW，观察预览图象的亮度。选择适当的曝光时间使预览图片的亮度合适。点拍摄按纽拍摄，等待几秒钟后图片传回电脑并在PHOTOSHOP窗口里显示。继续拍摄下一

22、张照片。拍摄十几张照片后要及时保存照片。先关闭相机控制按纽。并保存拍摄条件到默认值。在PHOTOSHOP中保存刚拍摄的照片到指定文件夹中，保存后要关闭照片。保存并关闭全部照片后重新打开相机控制窗口继续拍摄。拍摄全部完成后保存所拍摄的照片。需要时将照片通过网络上传到校园网服务器上，不能使用U盘或软盘转移文件。或者将照片文件刻录到光盘上。（4）关机关闭显微镜电源。关闭汞灯电源。关闭数码相机电源。关闭电脑。53结果抗体结合不同的G蛋白，G蛋白被用来检测这些与转导有关的蛋白的表达是否与嗅觉受体神经元（ORNS）的形态类型相对应。在本次实验中使用的三种抗体分别为GOLF/S抗体，GO抗体，GQ/11抗体

23、。分别在大黄鱼嗅觉上皮组织中得到了清晰的标记。31GOLF/S的免疫组化反应图1G蛋白在上皮细胞中的免疫反应，抗体为GOLF/S。在大黄鱼组织切片中的侧面面图，GOLF/S的免疫反应主要体现在均匀分布在ORNS相对均匀的分配在了感觉区。许多标记了组织表面的细长状细胞。FIGURE1GPROTEININEPITHELIALCELLSOFTHEIMMUNERESPONSE,ANTIBODYGOLF/STISSUESECTIONSINTHELARGEYELLOWCROAKERINTHESIDESURFACEMAP,GOLF/SOFTHEIMMUNERESPONSEMAINLYREFLECTEDINT

24、HEUNIFORMDISTRIBUTIONOFRELATIVELYUNIFORMINTHEORNSINTHESENSORYAREAMANYMARKTHESURFACEOFTHEELONGATEDSHAPEOFTHETISSUECELLS在荧光显微镜下OLYMPUSBX60，40倍放大情况下，大黄鱼组织被GOLF/S结合，在绿色荧光下的照片。在图中显示为，在组织的外围四周有明显的长条状的荧光，而其他部位均没有较强荧光显示。GOLF/S抗体只均匀标记了薄片四周的长形细胞。GOLF/S标记在纤毛中是最凸出的。如同从荧光显微镜下观察到的，GOLF/S是存在于纤毛中并且主要体现在纤毛嗅觉受体神经元（OR

25、NS）的细胞膜中。632GO的免疫反应性图2G蛋白在上皮细胞中的免疫反应，抗体为GO。在大黄鱼组织拨片中的侧面图，GO的免疫反应主要体现在均匀分布在ORNS相对均匀的分配在了感觉区。许多标记了组织表面的大部分颗粒细胞以及少量不规则形状光斑。FIGURE2GPROTEININEPITHELIALCELLSOFTHEIMMUNERESPONSE,ANTIBODYGOORGANIZATIONSINTHEALLOCATIONOFLARGEYELLOWCROAKERFILMSIDEVIEW,GOIMMUNERESPONSEMAINLYREFLECTEDINTHEUNIFORMDISTRIBUTIONOF

26、RELATIVELYUNIFORMINTHEORNSINTHESENSORYAREAMANYORGANIZATIONSMARKEDTHESURFACEOFMOSTOFTHEGRANULOSACELLSANDASMALLIRREGULARSPOTS在荧光显微镜下OLYMPUSBX60，40倍放大，大黄鱼组织被GO抗体结合后，在绿色荧光下的照片拍得的照片。从照片中我们可以明显的分辨出的组织的表面上大量紧密的分布着一些颗粒状的强荧光斑点。以及少量一些面不规则形状的光斑。而其他位置均没有明显的荧光显示。在大黄鱼的嗅觉上皮的组织中，GO抗体标记了隐窝嗅觉受体神经元（ORNS）的细胞质（见图2）以及一些基

27、底细胞的细胞质。除此之外，衰弱的GO标记出现在一些短或者中高细胞中，这些细胞很明显是微绒毛嗅觉受体神经元（ORNS）。在GO标本的超薄的区域，一些微绒毛嗅觉受体神经元（ORNS）的细胞膜显现出衰弱的标记。733GQ/11的免疫反应性图3G蛋白在上皮细胞中的免疫反应，抗体为GQ/11。在大黄鱼组织拨片中的侧面图，GQ/11的免疫反应主要体现在均匀分布在ORNS相对均匀的分配在了感觉区。许多标记了组织表面的点状细胞。FIGURE3GPROTEININEPITHELIALCELLSOFTHEIMMUNERESPONSE,ANTIBODYGQ/11ORGANIZATIONSINTHEALLOCATIO

28、NOFLARGEYELLOWCROAKERFILMSIDEVIEW,GQ/11IMMUNERESPONSEMAINLYREFLECTEDINTHEUNIFORMDISTRIBUTIONOFRELATIVELYUNIFORMINTHEORNSINTHESENSORYAREAMANYLABELEDCELLSINTISSUESURFACEOFTHESPOTS在荧光显微镜下OLYMPUSBX60，40倍放大，大黄鱼组织被GQ/11抗体结合后在绿色荧光下观察得到的的照片。通过照片分析得到，在组织的顶部分布着一些点状的强荧光斑点，而其他部分明显没有强荧光现象。由此分析得到，GQ/11类的免疫反应力通常以点

29、状的方式发生在嗅上皮细胞的表面。在对超薄部分的测试中表现出GQ/11标记了微绒毛嗅觉受体神经元（ORNS）。在荧光显微镜下，极有可能与斑点状顶端的标记相一致。这些细胞的细胞膜很少被标记。与微绒毛嗅觉受体神经元（ORNS）细胞相一致。34在DAPI染色下，观察细胞核分布8图4A在绿色荧光下，100倍放大，被GOLF/S结合的大黄鱼嗅觉上皮组织在荧光显微镜下观察得到的照片。FIGURE4AINTHEGREENFLUORESCENCEUNDER100TIMESMAGNIFICATION,WASGOLF/SCOMBINEDWITHTHELARGEYELLOWCROAKERINTHEOLFACTORYE

30、PITHELIUMOBSERVEDBYFLUORESCENCEMICROSCOPEPHOTOGRAPHS图4B在蓝色荧光下，100倍放大，被GOLF/S结合的大黄鱼嗅觉上皮组织在荧光显微镜下观察得到的照片。在照片中分布着十分密集的高荧光亮点，是因为细胞核在被DAPI染色后，在蓝色荧光下产生的的亮点。每一个亮点均代表该处有一细胞核，从而可以推断出在该片组织中细胞的排列。FIGURE4BBLUEFLUORESCENCEUNDER100TIMESMAGNIFICATION,WASGOLF/SCOMBINEDWITHTHELARGEYELLOWCROAKERINTHEOLFACTORYEPITHELI

31、UMOBSERVEDBYFLUORESCENCEMICROSCOPEPHOTOGRAPHSINTHEPHOTOAVERYDENSEDISTRIBUTIONOFHIGHFLUORESCENCEBRIGHTSPOTISTHATBEINGDAPISTAINEDNUCLEIINBLUEFLUORESCENCEARISINGUNDERHIGHLIGHTAREREPRESENTATIVEOFEACHDEPARTMENTHASABRIGHTNUCLEUS,WHICHCANBEINFERREDINTHEARRANGEMENTOFCELLSINTISSUESOFTHEFILM通过两张照片的的对比分析观察，在图4

32、A中产生绿色强荧光的部位在图4B中均没有产生蓝色荧光。通过这一现象可以分析得到如下结论，在该片组织中只有部分细胞被抗体GOLF/S结合，且结合部分主要为蛋白质组成，并且被结合部分主要存在于组织四周的表面部分。4讨论在鱼类中建立的细胞集合并关系着气味的神经元够成三个不同形状的类型。第一种感觉神经元有着较长的树突和一些纤毛；第二种感觉神经元的顶面微绒毛神经元的树突较纤毛细胞短且在其表面有波状的的延伸2627；第三种类型称为隐窝细胞2829。这些细胞呈球形或梨形，接近上皮细胞表面还附着了一些纤毛。由于不同长度，不同类型的树突、位于不同深度范围的体细胞和感觉上皮伪分层现象的形成。不同类型的嗅觉受体神经

33、元（ORNS）使用不同的转导机制和伴随的G蛋白30。鱼类方面的研究，在鲶鱼实验中，研究也发现不同类型的嗅觉受体神经元（ORNS）使用不同的G蛋白纤毛嗅觉受体神经元（ORNS）使用GOLF/S，许多微绒毛嗅觉受体神经元（ORNS）使用GQ/11，隐窝嗅觉受体神经元（ORNS）则使用GO。我们的荧光显微镜分析都体现出GQ/11的免疫反应力反生在上皮细胞的上端的细胞中，这些细胞带有微绒毛。9表1鲶鱼嗅觉组织中不同类型感觉神经元之间的关系，味觉受体以及G蛋白的关系TABLE1ORGANIZATIONOFCATFISHOLFACTORYSENSORYNEURONSOFDIFFERENTTYPESOFRE

34、LATIONSHIPBETWEENTASTERECEPTORSANDGPROTEININTYPEOFSENSORYNEURONEODORANTRECEPTORGPROTEINCILIATEDSENSORYNEURONESOROR1G,OLFG,OLFZORSGOLFMICROVILLOUSSENSORYNEURONESV2RG,O,G,Q,G,I3ZVRSG,OCASR524GOGFAORCLASSICRYPTCELLSV1RG,O,G,QG,OCASR313GFBV2R不同气味受体类型和G蛋白分配可以通过原位杂交判断出断出。其中包括纤毛细胞，微绒毛和隐窝细胞。问号表明还存在的一定的不确定性。

35、气味受体和G蛋白表达型有很强的相关性。DIFFERENTODORANTRECEPTORTYPESANDGPROTEINDISTRIBUTIONINSITUHYBRIDIZATIONCANDETERMINETHEBREAKOUTINCLUDINGCILIATEDCELLS,MICROVILLIANDCRYPTCELLSQUESTIONMARKSINDICATETHATTHERESSOMEUNCERTAINTYODORANTRECEPTORANDGPROTEINTYPEASTRONGCORRELATION通过该实验的结果分析可以得出如下结论，从浙江省宁波市象山县西沪港采样的大黄鱼的嗅觉上皮组织中存

36、在着以下三种G蛋白分别为GOLF/S；GO；GQ/11。并且与这些嗅觉受体神经元（ORNS）的形态与细胞类型相对应。即，GOLF/S存在于纤毛嗅觉受体神经元（ORNS）的细胞膜中。GO大部分存在于隐窝嗅觉受体神经元（ORNS）细胞质中，少量存在于微绒毛嗅觉受体神经元（ORNS）中。GQ/11存在于微绒毛受体神经元（ORNS）细胞表面。并通过与鲶鱼嗅觉上皮组织中G蛋白的对比与比较分析，得出在大黄鱼嗅觉上皮中存在着与鲶鱼嗅觉上皮组织中相同的G蛋白，并发挥相似的功能。65参考文献1LEGROS,CLARKWEOBSERVATIONSONTHESTRUCTUREANDORGANIZATIONOFOLF

37、ACTORYRECEPTORSINTHERABBITJYALEJBIOLMED,1956,2983952SKEENLCODORINDUCEDPATTERNSOFDEOXYGLUCOSECONSUMPTIONINTHEOLFACTORYBULBOFTHETREESHREWTUPAIAGLISJBRAINRES,1977,1241471533RESSLERKJ,SULLIVANSL,BUCKLBINFORMATIONCODINGINTHEOLFACTORYSYSTEMEVIDENCEFORASTEREOTYPEDANDHIGHLYORGANIZEDEPITOPEMAPINTHEOLFACTORYB

38、ULBJCELL,1994,79124512554KAUERJSCONTRIBUTIONSOFTOPOGRAPHYANDPARALLELPROCESSINGTOODORCODINGINTHEVERTEBRATEOLFACTORYPATHWAYJTRENDSNEUROSCI,1991,1479855BUCKL,AXELRANOVELMULTIGENEFAMILYMAYENCODEODORANTRECEPTORSAMOLECULARBASISFORODORRECOGNITIONJCELL,1991,651751876JONESDT,REEDRRGOLFANOLFACTORYNEURONSPECIF

39、ICGPROTEININVOLVEDINODORANTSIGNALTRANSDUCTIONJSCIENCE,1989,2447907957JIAC,HALPERNMSUBCLASSESOFVOMERONASALRECEPTORNEURONSDIFFERENTIALEXPRESSIONOFGPROTEINSGI_2ANDGO_ANDSEGREGATEDPROJECTIONSTOTHEACCESSORYOLFACTORYBULBJBRAINRES,1996,7191171288WEKESAKS,MILLERS,NAPIERAINVOLVEMENTOFGQ/11INSIGNALTRANSDUCTIO

40、NINTHEMAMMALIANVOMERONASALORGANJJEXPBIOL,2003,2068278329ZEISKEE,THEISENB,BREUCKERHSTRUCTURE,DEVELOPMENT,ANDEVOLUTIONARYASPECTSOFTHEPERIPHERALOLFACTORYSYSTEMJINFISHCHEMORECEPTION,1992133910MEISAMIE,BHATNAGARKPSTRUCTUREANDDIVERSITYINMAMMALIANACCESSORYOLFACTORYBULBJMICROSCRESTECH,1998,4347649911MORANDT

41、,ROWLEYIIIC,JAFEKBWELECTRONMICROSCOPYOFHUMANOLFACTORYEPITHELIUMREVEALSANEWCELLTYPETHEMICROVILLARCELLJBRAINRES,1982,253394612MORITAY,FINGERTEDIFFERENTIALPROJECTIONSOFCILIATEDANDMICROVILLOUSOLFACTORYRECEPTORCELLSINTHECATFISH,ICTALURUSPUNCTATUSJJCOMPNEUROL,1998,39853955013THOMMESENGTHESPATIALDISTRIBUTI

42、ONOFODORINDUCEDPOTENTIALSINTHEOLFACTORYBULBOFCHARANDTROUTSALMONIDAEJACTAPHYSIOLSCAND,1978,10220521714HANSEN,A,ANDERSON,KT,FINGER,TEDIFFERENTIALDISTRIBUTIONOFOLFACTORYRECEPTORNEURONSINGOLDFISHSTRUCTURALANDMOLECULARCORRELATESJCOMPNEUROL,2004,47734735915CAO,Y,OH,BC,STRYER,LCLONINGANDLOCALIZATIONOFTWOMU

43、LTIGENERECEPTORFAMILIESINGOLDFISHOLFACTORYEPITHELIUMJPROCNATLACADSCIUSA,1998,95119871199216SPECA,DJ,LIN,DM,SORENSEN,PW,ETALFUNCTIONALIDENTIFICATIONOFAGOLDFISHODORANTRECEPTORJNEURON1999,2348749817SATO,Y,MIYASAKA,N,YOSHIHARA,YMUTUALLYEXCLUSIVEGLOMERULARINNERVATIONBYTWODISTINCTTYPESOFOLFACTORYSENSORYNE

44、URONSREVEALEDINTRANSGENICZEBRAFISHJJNEUROSCI,2005,254889489718NIKONOV,AA,FINGER,TE,CAPRIO,JBEYONDTHEOLFACTORYBULBANODOTOPICMAPINTHEFOREBRAINJPROCNATLACADSCIUSA,2005,10218688186936619JEFFERIS,GSXE,HUMMEL,TWIRINGSPECIFICITYINTHEOLFACTORYSYSTEMSEMINJCELLDEVBIOL,2006,175020HAMDANI,EH,LASTEIN,S,GREGERSEN

45、,F,ETALSEASONALVARIATIONSINTHEAPPEARANCEOFCRYPTCELLSINTHEOLFACTORYEPITHELIUMOFTHECRUCIANCARPJ17THCONGRESSOFTHEEUROPEANCHEMORECEPTIONRESEARCHORGANIZATION,GRANADA,SPAIN,200612621THOMMESENGTHESPATIALCONCEPTINFISHOLFACTIONJPHDTHESIS,UNIVERSITYOFOSLO198322CARRWETHEMOLECULARNATUREOFCHEMICALSTIMULIINTHEAQU

46、ATICENVIRONMENTJSENSORYBIOLOGYOFAQUATICANIMALSATEMAJ,FAYRR,POPPERAN,TAVOLGAWN,EDS,198832723HARATJ,ZHANGCSPATIALPROJECTIONSTOTHEOLFACTORYBULBOFFUNCTIONALLYDISTINCTANDRANDOMLYDISTRIBUTEDPRIMARYNEURONSINSALMONIDFISHESJNEUROSCILETT,1996,26657424HARATJ,ZHANGCTOPOGRAPHICBULBARPROJECTIONSANDDUALNEURALPATHW

47、AYSOFTHEPRIMARYOLFACTORYNEURONSINSALMONIDFISHESJNEUROSCIENCE,1998,8230131325SORENSENPW,CAPRIOJCHEMORECEPTIONJTHEPHYSIOLOGYOFFISHESEVANSDH,ED,199837540526SATO,Y,MIYASAKA,N,YOSHIHARA,YMUTUALLYEXCLUSIVEGLOMERULARINNERVATIONBYTWODISTINCTTYPESOFOLFACTORYSENSORYNEURONSREVEALEDINTRANSGENICZEBRAFISHJJNEUROS

48、CI,2005,254889489727YAMAMOTO,M,UEDA,KCOMPARATIVEMORPHOLOGYOFFISHOLFACTORYEPITHELIUMXPERSIFORMES,BERYCIFORMES,SCORPAENIFORMES,ANDPLEURONECTIFORMESJJFACSCITOKYOUNIVSECIVZOOL,1979,1427329728HANSEN,A,ELLER,P,FINGER,TEETALTHECRYPTCELLAMICROVILLOUSCILIATEDOLFACTORYRECEPTORCELLINTELEOSTFISHESJCHEMSENSES,19

49、97,2269469529DELLACORTEC,RESTREPOD,MENCOBPHMETALGQ/G11IMMUNOLOCALIZATIONINTHEOLFACTORYEPITHELIUMOFTHERATRATTUSRATTUSANDTHECHANNELCATFISHICTALURUSPUNCTATUSJNEUROSCIENCE,1996,7426127330SCHANDARM,LAUGWITZKL,BOEKHOFFI,ETALSCHULTZG,BREERHODORANTSSELECTIVELYACTIVATEDISTINCTGPROTEINSUBTYPESINOLFACTORYCILIAJJBIOLCHEM,1998,273166691667731ABOGADIEFC,BRUCHRC,FARBMANAIGPROTEINSUBUNITSEXPRESSEDINCATFISHOLFACTORYRECEPTORNEURONSJCHEMSENSES,1995,2019920632MIYAMOTOT,RESTREPOD,CRAGOEJETAL