分子印迹基质固相分散-液相色谱法测定水产品中的磺胺类抗生素残留【毕业设计】.doc

1、本科毕业设计（20_届）分子印迹基质固相分散液相色谱法测定水产品中的磺胺类抗生素残留所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月I目录1引言211渔药残留212渔药残留的危害2121对鱼本身直接的危害2122对人间接的危害213渔药残留问题与食品贸易214磺胺类抗生素特性与应用315本文研究的基本原理和内容316应解决的问题32实验部分421仪器和试剂4211药品试剂4212实验仪器和材料422实验方法4221标准曲线的绘制4222高效液相色谱条件4223分子印迹聚合物的制备及评价42231分子印迹聚合物的制备52232分子印迹聚合物固相萃取分析评价5224分子印迹基质固相分散

2、萃取52241样品制备及净化52242样品回收率及精密度测定52243检测限和定量限测定53结果与分析531标准曲线的测定与线性关系532精密度的测定633检测限和定量限测定734添加回收率735虾和鱼样品加标的HPLC色谱图84小结8致谢8参考文献9附录错误未定义书签。摘要兽药残留是影响水产品安全的重要因素之一，不仅给水产养殖自身带来影响，而且对人体健康产生危害。为从源头上控制渔药的使用，需要建立痕量残留违禁药物的快速分离纯化方法，提高分析方法的精确度和灵敏度。本论文以虾、鱼水产品为实验对象，建立基于分子印迹技术的对磺胺类抗生素（SULFONAMIDES,SAS）具有特异选择性的分子印迹基质

3、固相分散萃取技术，对水产品中的SAS进行分离、纯化，进一步结合高效液相色谱法，建立水产品中SAS检测的新方法。结果表明，虾和鱼样品中磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺5甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲氧嘧啶的最低检测限分别为94118G/KG和94114G/KG，最低定量限分别为271316G/KG和250286G/KG，六种SAS回收率均达80以上，该方法能够达到国家标准的要求，适用于检测水产品中的磺胺类药物残留。关键词分子印迹技术；基质固相分散；液相色谱法；磺胺类抗生素；水产品ABSTRACTTHEVETERINARYDRUGSRESIDUEISONEOFTHEDIRECTIMPAC

4、TSONTHESAFETYOFAQUATICPRODUCTS,WHICHEXHIBITEDTHEHARMFULEFFECTONTHEAQUACULTUREANDTHEHUMANHEALTHTOCONTROLTHEUSAGEOFTHEABUSEDDRUGS,THEISOLATIONANDPURIFICATIONMETHODSWEREDEVELOPEDFORIMPROVINGTHESENSITIVITYANDACCURACYOFTHEDETECTIONMETHODINTHISSTUDY,ANEWMETHOD,MOLECULARLYIMPRINTEDMATRIXSOLIDPHASEDISPERSIO

5、NTECHNIQUE,FORSASDETERMINATIONBASEDMOLECULARLYIMPRINTEDTECHNIQUEWASDEVELOPEDFURTHER,COUPLEDWITHREGULARHPLCANALYSIS,THESASRESIDUESINFISHANDSHRIMPSAMPLESWEREDETERMINEDTHERESULTSSHOWEDTHATTHELODS/N3OFTHEDEVELOPEDMETHODFORSULFADIAZINESDZ,SULFAMERAZINESM,SULFAMETERSME,SULFAMETHZAINESMZ,SULFAMETHOXIAZOLES

6、MX,SULFADIMETHOXINESDMWERE94118G/KGAND94114G/KGRESPECTIVELY,LOQS/N10FORSDZ,SM,SME,SMZ,SMX,SDMOF271316G/KGAND250286G/KG,RESPECTIVELY,ANDRECOVERYRATEABOVE80THISNEWMETHODCANMEETTHENATIONALSTANDARDSFORTESTINGTHESASRESIDUESINAQUATICPRODUCTSANDCANBEAPPLIEDINPRACTICEKEYWORDSMOLECULARIMPRINTEDTECHNIQUEMATRI

7、XSOLIDPHASEDISPERSIONLIQUIDCHROMATOGRAPHYSASAQUATICPRODUCTS21引言随着食品贸易不断的国际化和全球经济一体化的迅速发展，食品安全已成为一个世界性的挑战和全球重要的公共卫生安全问题，其中兽药残留是影响动物源食品安全的重要因素之一，主要的兽药残留有抗生素类、磺胺类、呋喃药类和激素药类等。渔药即渔用药品的简称，渔药残留是影响水产品类食品安全的主要因素之一。渔药是用于预防、控制和治疗鱼病的药物，因磺胺类抗生素药物具有抗菌范围广、杀菌能力强等优点，是防治水产动物细菌性疾病的主要渔药药物1。11渔药残留我国渔药的研究和应用开始于上世纪50年代左右，

8、渔药的开发不过几十年历史，刚开始形成产业。近几十年来，渔药在水产养殖业中的应用日益广泛。施用渔药是渔业生产养殖中，为预防和控制鱼类病害，降低生物发病率与死亡率，减少养殖损失，提高经济效益的一项必需的工作。随着我国水产养殖业的蓬勃发展，越来越多的渔药药物被应用在渔业生产中，这些药物的使用几乎贯穿于养殖的全过程中。由于科学知识的缺乏和经济利益的驱动，不合理地使用和滥用渔药的情况普遍存在。由于水产动物本身代谢功能所限和渔药自身的理化特性，因此并非所有被吸收进体内的渔药都能完全排出体外，而是蓄积在水产动物组织和器官内即产生渔药残留。这种现象不仅威胁水产品本身，还通过食物链进入人体，对人类健康构成威胁。

9、12渔药残留的危害121对鱼本身直接的危害近几年来，我国频频发生食品安全问题，给各行业带来了巨大的影响，渔业也难逃厄运。过量使用渔药如重金属类的渔药，被鱼体吸收后会妨碍鱼体肠道酶如胰蛋白酶、淀粉酶等的作用，影响鱼体摄食生长，甚至可使鱼肾小管扩大，其周围组织坏死，造血组织毁坏，以致增加脂肪肝的发生率。过量使用敌百虫会引起鱼和帆蚌半个月或一个月不摄食，最后导致体力衰竭而死。过量使用渔药双甲脒，不仅对鱼有较大毒性，其中间代谢产物也有致癌作用，如不慎使用甚至过量使用，就会给渔业造成经济损失。122对人间接的危害当我们食用含有渔药残留的动物性食品后，一般不表现出急性毒性作用。但如果长时间摄入低剂量的渔药

10、残留的动物性食品，因渔药在人体内的代谢时间较长，可造成残留渔药在人体内蓄积，当达到一定浓度时就会对人体的机能产生损害，引起体内一些组织器官发生病变，甚至引起组织癌变3。摄入人体内的残留渔药对人体的危害主要表现在以下几个方面1“三致”即致癌、致突变和致畸作用。如孔雀石绿和双甲脒等渔药都有致癌的作用，呋喃类渔药能引起人体体细胞染色体突变和致畸4。2毒性作用。如磺胺类渔药可引起人体肾脏机能损害，氯霉素可引起再生障碍性贫血，诱发白血病。3过敏反应。如青霉素、磺胺类、呋喃类渔药都能引起人群的过敏反应，严重时可引起休克。4耐药性。水生动物在服用抗生素类渔药后易产生耐药菌株。如果这些耐药菌株传递给人，将会给

11、临床治疗带来很大困难。5扰乱激素分泌作用。丙酸睾酮、甲基睾丸酮、已烯雌酚等激素，都会扰乱人体激素分泌平衡，导致儿童性早熟，或诱发女性乳腺癌等5。因此，加强渔药的管理、使用和检测已经成为我国渔业生产中迫在眉睫的问题。13渔药残留问题与食品贸易3鉴于渔药残留的危害性，联合国食品法典委员会CAC以及许多国家都规定，水产品和水产动物饲料中的磺胺类药物总量以及磺胺二甲基嘧啶等单磺胺类药物的量均不得超过01MG/KG；日本规定食品中不得检出磺胺类药物，其方法检测限为001005MG/KG6。众多质量安全问题影响着动物源食品在国内和国际间的正常贸易7。据海关数据统计，2010年我国水产品出口量33388万吨

12、、出口额13828亿美元，双双创出历史新高，同比分别增长126和2809。但水产品的质量安全问题，直接关乎出口产品检疫是否能通过。如近几年来，2005年10月，韩国对申请进口的15吨中国产活鲈鱼进行检查，查出孔雀石绿，对该产品作出销毁及返货处理。2006年68月期间，我国水产品出口日本就被多次查出药物残留。2007年6月28日，美国食品和药品管理局FDA宣布从当日起，扣查从我国进口的未经检验的对虾、鳗鱼、叉尾、鲮鱼和巴沙鱼五类水产品。2008年11月，日本在从我国进口的鳗鱼产品中检出三聚氰胺19PPM（即19毫克/千克），等等。为避免这种情况的发生，除了从源头上控制兽药的使用之外，如何快速分离

13、复杂样品中痕量的检测物、降低检测低限、提高分析方法的精确度和灵敏度以及建立快捷、经济、准确的检测技术，也是一项重要的工作。14磺胺类抗生素特性与应用从1932年合成第一个磺胺类药物“百浪多息”以来，已有近80年历史，先后合成的这类药物约9000种。磺胺类药物（SULFONAMIDES，SAS）是指由磺胺衍生的，具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称。磺胺类抗生素是一类化学合成的抗生素，常用作预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。从应用角度来说，磺胺类药物是一类具有广谱抗菌性的药物，对水产养殖中的细菌性竖鳞病、烂鳃病、弧菌病、赤鳍病、肠炎、鞭毛虫病等有良好的防治效果。磺胺药曾广泛应用于水产养殖

14、中，在控制鱼病传染和感染方面起了很大作用，解决了不少水产养殖中存在的问题8。但也带来了磺胺类残留和环境污染等一系列问题。因其危害日益严重，国内外均对磺胺类的残留有限量标准。国际食品法典委员会CAC规定，食品和饲料中磺胺类药物总量以及磺胺二甲基嘧啶等单个磺胺类药物的量均不得超过01MG/KG。我国规定磺胺类药物总量不得超过03MG/KG9。15本文研究的基本原理和内容固相萃取是兽药残留分析常用的样品处理与富集方法。因基质固相分散常用的吸附剂主要为硅藻土和硅胶，选择性较差。而分子印迹聚合物MIP是一类具有较强分子识别能力的新型高分子仿生材料，具有预定性、识别性和实用性等特点，适合于复杂样品的前处理

15、10。分子印迹聚合物固相萃取柱具有稳定的立体空穴结构，作用原理不同于传统固相萃取柱，可反复使用，从而可以降低检测成本。陈小霞等制备了氯霉素MISPE柱，用于生物制品和动物性食品的检测，效果较好11。高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论，具有气相层析的全部优点，分离能力强，测定灵敏度高，可在室温下进行，应用范围极广12。故本文采用分子印迹聚合物，基质固相分散技术和高效液相色谱法多种方法联用，避开单方法的缺点，集众方法优点于一身，来满足日益增长的水产品消费检测、进出口检疫。首先获得对磺胺类类抗生素特异的分子印迹聚合物，以对模板分子具有较强识别特性的分子印迹聚合物

16、为基质固相分散吸附剂，获得可高效分离纯化水产品样品中磺胺类类抗生素的分子印迹基质固相分散萃取条件，提取水产品中的痕量磺胺类抗生素，最后建立基于分子印迹基质固相分散萃取技术的水产品样品中磺胺类抗生素的检测方法（HPLCUV）。同时研究了磺胺类分子印迹聚合物对样品中磺胺类抗生素的提取和净化效果。16应解决的问题4本研究面临的问题是水产品中的渔药残留水平较低，样品基质提取较复杂，同时干扰物质较多，要尽可能除去与目标物同时存在的杂质，并减少色谱干扰峰的出现，避免对检测器和色谱柱的污染13。本研究的主要技术难点在于获得对磺胺类类抗生素特异的分子印迹聚合物；获得可高效分离纯化水产品样品中磺胺类抗生素的分子

17、印迹基质固相分散萃取条件14；提高检测的灵敏度。目前分子印迹基质固相分散与高效液相色谱法，三法联用在渔药残留分析中的文献较少1522，并且该方法对前处理技术要求比较严格。2材料与方法21仪器和试剂211药品试剂磺胺嘧啶SDZ，磺胺甲嘧啶SM，磺胺5甲氧嘧啶SME，磺胺二甲基嘧啶SMZ，磺胺甲噁唑SMX，磺胺二甲氧嘧啶SDM，甲基丙烯酸MAA，以上药物均购自SIGMAALDRICH公司。交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）由FLUKA公司提供。偶氮二异丁腈购自中国医药集团总公司（中国上海）。乙腈、甲醇为色谱纯，均购自FISHER科技有限公司（美国）。所有其它的试剂必须是分析纯。212实验仪器

18、和材料高效液相色谱系统（LC10AVP）（AGELATECHNOLOGIES日本岛津公司），紫外检测仪，氮气吹干仪（HGC212A，上海），固相萃取装置，离心机，组织捣碎机，电子分析天平，电热恒温水浴锅，超声波清洗器，精密取液器（20L），实验材料为虾、鱼水产品（宁波市售的水产品样品）。22实验方法221标准曲线的绘制将各种磺胺类抗生素以甲醇稀释至所需混合标准浓度系列，浓度系列为002、005、01、02、05、1MG/KG，然后各取20L向高效液相色谱进样测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标，标准浓度为横坐标，分别来绘制各个药物的标准曲线，并计算得到回归曲线和相关系数。222高效液相色谱条件高效

19、液相色谱系统（LC10AVP），VENUSILXBPC18（46250MM，粒径为5M）（AGELATECHNOLOGIES日本岛津公司）；流动相A甲醇B1醋酸2872，保持6MIN，出峰时间在610MIN时，甲醇体积分数从32增长至50，出峰时间在1018MIN时，甲醇体积分数从50增长至75，出峰时间在25MIN时，甲醇体积分数恢复至初始流动相（梯度洗脱程序见表1）；流速1ML/MIN；检测波长为270NM；柱温为室温；进样量为20L；氮气吹干仪（HGC212A，上海）。定量方法外表法定量。表1流动相梯度（A甲醇；B1HAC）洗脱程序时间MINAB001287260032681000505

20、0180075252000752525002878223分子印迹聚合物的制备及评价52231分子印迹聚合物的制备磺胺类分子印迹聚合物的制备过程预聚合溶液由1MMOL模板分子，5ML乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）交联剂，120MG偶氮二异丁腈引发剂，溶解在圆底烧瓶15ML乙腈中一定量的MAA功能单体组成。该混合溶液在氮气中超声10MIN，以排除氧气。烧瓶中的混合物在60C水浴中聚合反应24H。丙酮中反复沉淀以除去细小颗粒，粉碎并过筛后可得到大量聚合物。收集体积小于60M的聚合物颗粒，一个个的在甲醇/甲酸（90/10，V/V）中洗净，直到通过高效液相色谱紫外分析检测不到磺胺类药物为止。然后用甲

21、醇去除模板分子和剩余未反应的功能单体。非印迹聚合物（NIP）合成过程中不添加模板分子，其他操作程序和条件与印迹聚合物合成相同。2232分子印迹聚合物固相萃取分析评价向底部带有垫片的1ML固相萃取柱中，填充25MG干分子印迹聚合物，分别制备分子印迹聚合物固相萃取柱和非印迹聚合物固相萃取柱。装载样品前，萃取柱相继用1ML甲醇和1ML乙酸/水（1/99，V/V）进行调整。进行每一个步骤前，都要用3ML甲醇/乙酸（9/1，V/V）洗脱分析物。洗脱物在氮气中蒸发至干，流动相中重新溶解，以便高效液相色谱进一步分析。结果显示聚合物MIP中磺胺类药物回收率比聚合物NIP中显著要高，见表2。表2各组分及对聚合物

22、保持性能评价聚合物模板模板单体回收率A交联剂SDZSMSMESMZSMXSDMMIPSDM10440857869928903862893NIP00440348317349312394294AN3；水作为填充溶剂。填充溶液的浓度为01MGKG1，填充溶液量为1ML，用1ML乙腈洗涤，31ML甲醇洗脱。224分子印迹基质固相分散萃取2241样品制备及净化分别称取02G已捣碎的虾和鱼样品于玻璃研钵中，再加入05G分子印迹聚合物，用研钵磨碎，并使样品与填料混合均匀。进一步匀浆后，取下端带有垫片的10ML固相萃取小柱（预装20MG分子印迹聚合物），将样品装柱，上面垫滤纸轻轻压紧。依次用20ML水、10乙

23、腈水溶液淋洗，然后用3ML甲醇/甲酸（90/10，V/V）洗脱。洗脱液在40C氮气中吹干后，然后再加05ML流动相溶解残渣，过022M滤膜后，按上述色谱条件进行HPLC测定分析。2242样品回收率及精密度测定分别称取空白样品50G，定量加入磺胺类抗生素标准品，配制3个不同的浓度，研钵中充分混匀，静置一段时间。按上述色谱条件进行HPLCUV检测，根据峰面积计算回收率及精密度。2243检测限和定量限测定将磺胺类抗生素分别加入空白样品中，按信噪比S/N3、S/N10，分别确定最低检测限和最低定量限。3结果与分析31标准曲线的测定与线性关系将绘制标准曲线的混合标准液，依次从低浓度到高浓度，按色谱条件进

24、行分析。通过高效液相色谱法6测定磺胺类药物峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X）绘制各个药物的标准曲线。并计算线性方程和相关系数，见表3。实验结果显示在00210MG/KG浓度范围内，峰面积与溶液浓度呈良好的线性关系。混合标准溶液的色谱图见图1。表3磺胺类药物的线性方程及相关系数磺胺类药物线性方程相关系数R2磺胺嘧啶Y41206X4371109999磺胺甲嘧啶Y63795X4507709999磺胺5甲氧嘧啶Y62380X1727709999磺胺二甲基嘧啶Y79648X2868109998磺胺甲噁唑Y65603X1190809998磺胺二甲氧嘧啶Y76397X3964709998图16种磺胺类药物混

25、合标准溶液色谱图磺胺嘧啶SDZ，磺胺甲嘧啶SM，磺胺5甲氧嘧啶SME，磺胺二甲基嘧啶SMZ，磺胺甲噁唑SMX，磺胺二甲氧嘧啶SDM32精密度的测定把含量为050MG/KG的磺胺类抗生素混合标准溶液重复进样5次，分别测定其峰面积。磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺5甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺甲噁唑，磺胺二甲氧嘧啶，平均峰面积分别为20424、317125、314665、403625、328105、409725，相对标准偏差分别为22、13、11、12、28、15（N5），见表4。结果表明仪器具有较好的精密度。表4磺胺类药物精密度的测定药物名称平均峰面积相对标准偏差磺胺嘧啶2042422磺胺甲嘧啶31

26、712513磺胺5甲氧嘧啶31466511磺胺二甲基嘧啶40362512磺胺甲噁唑32810528磺胺二甲氧嘧啶40972515733检测限和定量限测定信噪比S/N为3时，虾样品中磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺5甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺甲噁唑，磺胺二甲氧嘧啶的最低检测限为118、111、114、108、98、94G/KG，S/N为10时，最低定量限为271、316、288、273、293、283G/KG。信噪比S/N为3时，鱼样品中磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺5甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺甲噁唑，磺胺二甲氧嘧啶的最低检测限为107、112、114、106、94、99G/KG，S/N为10时，

27、最低定量限为262、280、272、286、250、256G/KG，见表5，磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺5甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺甲噁唑，磺胺二甲氧嘧啶的检测限和定量限满足水产品中6种SAS残留的定量测定要求。表5检测限和定量限测定结果药物名称S/N3时，最低检测限（G/KG）虾鱼S/N10时，最低定量限（G/KG）虾鱼磺胺嘧啶118107271262磺胺甲嘧啶111112316280磺胺5甲氧嘧啶114114288280磺胺二甲基嘧啶108106273286磺胺甲噁唑9894293250磺胺二甲氧嘧啶949928325634添加回收率再以不含磺胺类药物的虾和鱼样品作为空白样品，分别做00

28、5MG/KG、01MG/KG、02MG/KG三个水平添加，进行回收率实验，结果见表6所示。表6虾和鱼样品中SAS加标分析（N3）磺胺类药物加样浓度005MG/KG01MG/KG02MG/KG回收率相对标准偏差A回收率相对标准偏差A回收率相对标准偏差A虾SDZ887618404285453SM1019488476492446SME896418973790136SMZ887338723990338SMX951419456191054SDM889498344485632鱼SDZ1028509164583945SM888409444589744SME958358265182453SMZ90064834

29、6283665SMX913528783484049SDM919438805380738从表6中可以看出，在上述三个添加浓度上，虾样品中磺胺类药物的平均加标回收率为8401019，8相对标准偏差在3264之间；鱼样品中磺胺类药物的平均加标回收率为8071028，相对标准偏差在3465之间。35虾和鱼样品加标的HPLC色谱图从图2中可以明显看出，虾和鱼样品在上述色谱条件下，基线平稳。该方法对虾和鱼水产品中的磺胺类药物残留检测，适用性较好，杂质干扰少。图2样品加标色谱图A虾样品加标色谱图B鱼样品加标色谱图4小结本研究采用分子印迹聚合物，基质固相分散技术和高效液相色谱法多种方法联用，对水产品虾和鱼中的

30、磺胺类药物残留进行了一系列实验，对样品前处理方法进行研究。经过对方法的改进和优化，有效解决了样品净化中物质残留的干扰。分子印迹聚合物基质固相分散技术具有稳定的空穴结构，可反复使用，样品与吸附剂均匀混合后填柱，用不同溶剂对杂质和目标分析物进行洗脱。高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论，具有气相层析的全部优点。分离能力强，选择性好，检测灵敏度高，可在室温下进行，分析速度快，应用范围极广。结果表明，分子印迹聚合物，基质固相分散技术和高效液相色谱法多种方法联用，虾和鱼样品中磺胺嘧啶，磺胺甲嘧啶，磺胺5甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶，磺胺甲噁唑，磺胺二甲氧嘧啶的最低检测限分

31、别为94118G/KG和94114G/KG，最低定量限分别为271316G/KG和250286G/KG，六种SAS回收率均达80以上，该方法能够达到国家标准的要求，适用于检测水产品中的磺胺类药物残留。9参考文献1巢磊磺胺类药物在水产养殖中的应用J水利渔业，2002，22350512古曼丽，史梅试论兽药残留的危害与对策J中国兽药杂志，2003，37473SORENTB,IRISCONSTANZEBEFFECTSOFSULFONAMIDEANDTETRACYCLINEANTIBIOTICSONSOILMICROBIALACTIVITYANDMICROBIALBIOMASSJCHEMOSPHERE,

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34、NOFVETERINARYANTIBIOTICSSULFONAMIDESANDTRIMETHOPRIMINANIMALMANUREBYLIQUIDCHROMATOGRAPHYMASSSPECTROMETJJOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,2002,95211112015徐靖，汪欢晃，刘娟等PVC玩具中壬基酚的分子印迹基质固相分散超高效液相色谱法测定J聚氯乙烯，2010，728353816郭琳媛分子印迹技术在渔药残留中的应用D兰州大学图书馆,兰州大学，200517王荣艳，王培龙，佘永新等分子印迹基质固相分散液相色谱法测定牛奶中的氯霉素残留J分析试验室，2009，288262818

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