纳米Al2O3对斑马鱼肝基因表达的影响【毕业设计】.doc

1、本科毕业设计（20_届）纳米AL2O3对斑马鱼肝基因表达的影响所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言12实验材料与方法121实验材料1211实验用鱼1212主要仪器和设备2213主要试剂222培养方法223实验方法2231染毒2232组织提取2233RNA的提取2234基因检测3235数据处理33结果331肝组织在纳米AL2O3处理不同时间下总RNA的提取432常规RTPCR检测相关基因的表达水平4321纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中HSP70基因表达的影响5322纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中MDR基因表达的影响5323纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中NKA基因表达的

2、影响6324纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中MTF1基因表达的影响74讨论841纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中HSP70基因表达的机理分析942纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中MDR基因表达的机理分析943纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中NKA基因表达的机理分析944纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中MTF1基因表达的机理分析95总结和展望10致谢错误未定义书签。参考文献2附录错误未定义书签。摘要纳米材料的生物安全性问题之所以受到科学家们的关注，是因为纳米材料特殊的物理化学性质可能会导致它们在生物体内的生理行为与常规物质不同，在环境中的行为也可能与常规物质不一样。本文应用浸浴法研究纳米AL2O3对斑马鱼肝

3、基因热休克蛋白70HSP70、多药耐药基因MDR、NAKATPASENKA、金属调节转录因子1MTF1表达的影响。结果表明，经56MGL1的纳米AL2O3处理不同时间后，发现经过6H的稳定期后各基因表达量均上调，一般在12H小时达到最大值，用BIOSENSGELIMAGINGSYSTEM软件对所得电泳图进行分析，求出各基因的相对含量，得出斑马鱼肝脏中HSP70、MDR、NKA、MTF1与对照组相比存在显著性差异（P51）加入氯仿，盖紧管盖，充分振荡混匀并将其在冰上孵育15MIN，然后于4，12000R/MIN，离心15MIN。离心后混合物分为三层，RNA存在于上清层中。4RNA的沉淀将上清层转

4、移至干净的EP管中，加入等体积冰浴的异丙醇，缓慢颠倒混匀，将样品在20下孵育20MIN以上，4，12000R/MIN，离心10MIN，RNA呈片状沉淀附着于管壁或管底；5RNA的洗涤弃去上清，用冰浴的75乙醇洗涤RNA沉淀12次，加入1ML75乙醇，颠倒洗涤管壁，并漩涡振荡样品，尽可能让沉淀悬浮，4，12000R/MIN，离心5MIN，弃去上清，晾干沉淀；6RNA的溶解及保存适度晾干沉淀避免过分干燥，会降低其可溶性，用适量无RNA酶水来溶解RNA，抽提好的RNA保存于40冰箱，同时加入适量RNA酶抑制剂。234基因检测1ONESTEPRTPCR扩增反应体系3表1ONESTEPRTPCR反应体系

5、RNASEFREEH2O55LFPRIME05LRPRIME05L2ONESTEPBUFFER125LRNA5LPRIMESCRIPTRONESTEPENZYMEMIX1LTOTAL25L2反应程序设置表2ONESTEPRTPCR反应条件循环次数温度时间11509430MIN2MIN26389430S5530S7230S17210MIN16保存3ACTIN、MDR、HSP70、NKA、MTF1基因的检测条件表3引物的退火温度及循环数基因退火温度循环数ACTIN5426MDR6038HSP705526NKA5834MTF15828235数据处理采用BIOSENSGELIMAGINGSYSTEM软

6、件将半定量图谱转化为定量数值，并用SPSS软件在对照组和实验组之间进行差显分析，认为P005时存在显著性差异，P001时存在极显著差异。43结果31纳米AL2O3处理不同时间后肝组织的总RNARNA提取的好坏是影响实验成功的关键，条带的清晰度可以用来说明RNA的降解率，图1为纳米AL2O3处理不同时间后肝组织总RNA的电泳图，有3条条带，分别对应沉降系数58S、18S、28S，含量在982914471NGL1,其中处理0H小时和处理6小时鱼肝的RNA质量较差，说明其在保存的过程被降解，存贮越久，降解的越厉害，虽然不以3条带出现作为RNA质量好坏的标准，因为这3种RNA在细胞内含量较多，但其清晰

7、度较高，说明实验相关的其他RNA的降解率也越低，一般以OD260/OD280值作为RNA质量的参照，越接近20，说明RNA纯度越高，经过超微量分度光度计分析，OD260/OD280值在196205之间，如表4所示，说明提取的RNA纯度较高，可以作为基因检测的模板。图1RNA提取条带（注0处理72H的鱼肝；1处理48H的鱼肝；2处理24H的鱼肝；3处理12H的鱼肝；4处理6H的鱼肝；5处理0H的鱼肝。）表4总RNA含量与纯度组号含量（NG/L纯度（OD260/OD280）对照144711966H1175820212H982920524H1713820148H1159519872H12136200

8、32常规RTPCR检测相关基因的表达水平ACTIN，即肌动蛋白，在各种生物组织或者细胞中其表达量较恒定，亮度之间的差异一般只与编码该蛋白的基因数目成正比，生物学上把这类编码基因称为持家基因。因此往往以ACTIN作为内参，来达到消除其余基因表达的差异由原初RNA含量不同带来的误差。经浓度为56MGL1纳米AL2O3处理不同时间后斑马鱼ACTIN测定的结果，如图2所示，处理6H与24H的比对照组测定较强，而另外三组12H、48H、72H均弱于对照组，说明原初RNA量并不完全相同，计算各基因的绝对含量与相应ACTIN含量并进行比值，求出各基因的相对含量，以排除由RNA含量的不同而导致的误差。58S1

9、8S28S0123455图2ACTIN基因的测定水平注M代表MARKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝。321纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中HSP70基因表达的影响纳米AL2O3处理不同时间得到的肝组织HSP70基因测定结果如图3、4所示，6H内HSP70表达量无明显变化，12H、24H、48H、72H时却显著增加（P005）（表5），12H达到最大值，说明斑马鱼经纳米AL2O3处理后，对HSP70基因表达有影响。图3HSP70基因的表达水平注M代表MARKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H

10、肝；6处理72H肝。图4HSP70的相对含量322纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中MDR基因表达的影响检测不同时间处理后斑马鱼MDR基因（图5），6H内表达量相对稳定，12H达到最大值，以后呈逐渐下降趋势，但整体上仍高于对照组（图5、6）。经纳米AL2O3处理后，斑马鱼肝组织中的MDR与处理时间虽然无明显的相关性，但与对照组都有显著差异（P005）（表5）。说明纳米AL2O3可以促进MDR基因的表达。1234562000BP1000BP750BP500BP200BP100BP350BP100BP200BP500BP750BP1000BP2000BP175BP123456MM6图5MDR基因的表达水

11、平注M代表MARKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝。图6MDR基因的相对含量323纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中NKA基因表达的影响图7所示为纳米AL2O3处理不同时间，斑马鱼NKA基因表达差异的结果。处理6H后NKA基因表达能力与对照相近，处理12H时达到最大值，12H以后强于对照组（图7、8），12H、48H、72H实验组中的NKA表达量与对照组相比有显差异（P005）（表5），表明纳米AL2O3可以促进NKA基因表达。450BP123456M7图7NKA基因的表达水平注M代表MARKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12

12、H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝。图8NKA基因的相对含量324纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中MTF1基因表达的影响与对照相比，不同时间处理斑马鱼MTF1表达强度无明显变化（图9）。处理6H附近无显著差异，其余处理时间12H、24H、48H、72H均有显著差异（P005）（表5、图10），但与处理时间无正相关性。图9MTF1基因的表达水平注M代表MARKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝。2000BP1000BP750BP500BP200BP100BP320BP123456345BPM8图10MTF1相对含量表5纳

13、米AL2O3处理与对照组相比肝脏中各基因显著性差异分析注F（）；F（）；表示H与对照相比存在显著性差异（P005）；表示H与对照相比存在高度显著性差异（P001）。4讨论41纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中HSP70基因表达的机理分析热休克蛋白70（HSP70）是指能够稳定另一种蛋白质的不稳定构想，具有高度保守的序列，并可通过有效地结合和释放、协助多聚体的组装或降解、新生肽的折叠延伸及细胞器蛋白的跨膜运输及调节、修复和降解变性的蛋白质方面起着重要作用的一类蛋白质家族12。刘迪秋13等报道了鲫鱼肝脏HSP70在重金属基因平方和DF均方F显著性HSP7017335347974140000431200

14、4MDR4309586272684200001412001NKA4309586272684200001412001MTF125450512974489000000120009CU、GE处理下表达均上调，HSP90在1MGL1CU处理12H表达至最大值。此外，HARTLFU14及SCHRODERH15等报道在体外胁迫下，HSP70分子伴侣能够起保护酶结构的作用。在本研究中，经过纳米AL2O3处理，斑马鱼肝组织内的HSP70基因表达量比对照均上调，在12H达到最大值，与其他实验结果类似，说明纳米AL2O3可能造成蛋白质的损伤或者变性，引起跨膜运输及调节、修复上的紊乱，为恢复机体正常功能，HSP70

15、基因被增强表达。但为了使实验更具有说明力，可以进一步从与HSP70功能相关的酶活性上研究。42纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中MDR基因表达的机理分析多药耐药性基因MDR1是指某种耐药细胞系对许多结构上无关的和作用机制不同的其它药物或化学品产生交叉耐药性的一类基因。MDR1过度表达生成的PGP糖蛋白）是MDR产生的最重要原因，而在正常情况下，PGP可以将渗入细胞内的有害物质排出体外，减小伤害。穆宝忠16等对MDR进行分子机理研究，发现正常组织发生肿瘤后，PGP表达依然强烈，给肿瘤治愈带来很大的难题17。本实验结果显示，经过纳米AL2O3处理，斑马鱼肝组织内的MDR基因表达量比对照均上调，在12H

16、达到最大值，说明机体在暴露在纳米材料下，随着纳米颗粒进入细胞内累积到一定量，机体为了维持自身功能的有序，MDR1基因被激活，编码过量的PGP将纳米材料排出体外，进行保护。但为了更系统地阐述纳米AL2O3与MDR的相关性，还需从与MDR表达或代谢功能相关的酶活性上研究。43纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中NKA基因表达的机理分析NAKATP基因（NKA）是指用于编码NAKATP酶的一类基因，主要功能是编码蛋白以维持细胞膜的通透性，保持细胞内环境中的相对稳定以及细胞内环境与体外环境的渗透压平衡，且对金属离子具有强敏感性。SFPERRY118等试验发现用生理盐水或140MMOLL1HCL处理虹鳟3H、

17、6H、12H时，存在显著差异（P005）。本实验中，经过纳米材料胁迫，导致细胞内外环境渗透压失衡，又因NKA对金属离子均有强敏感性，促进了NKA的表达，说明纳米材料在一定浓度范围内，可以诱导NKA基因的过量表达，以重新维持环境的稳定，不过超过一定的浓度范围就起抑制作用，如朱小山19等报告鲫鱼鳃组织内NAKATP酶活性在NC60/AQ为020MGL1时被激活，而在10MGL1时酶活性又开始下降，说明机体自我调节的能力有限。44纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中MTF1基因表达的机理分析金属调节转录因子1MTF1，又称锌指转录因子，能与金属硫蛋白（MT启动子的金属感应序列结合，调控其基因的表达，而金属

18、硫蛋白在基本金属元素的调节中起重要作用，并且对非基本的金属元素有抑制和解毒作用，MT20通过与重金属结合可以有效的减轻重金属对机体的毒害，是目前临床上最理想的生物螯合解毒剂，有研究表明21MTF1可被镉激活。本研究中，发现经纳米AL2O3处理一定时间后，MTF1基因被激活，编码产物又进一步调控金属硫蛋白翻译能力增强，产生大量MT以结合金属纳米铝，中和其毒性。说明机体将纳米材料视为外源毒物加以排除，通过调控金属硫蛋白表达产物与铝金属结合，起解毒和减轻重金属对机体的伤害。5总结和展望纳米材料具有良好的理化性质，所以国内外已经开始普遍使用。但由于体积微小，易通过呼吸道或者11气孔进入生物体内，也正因

19、为不知道其是否会对生态环境带来破坏，一系列有关纳米材料的研究正在进行中，通过本次研究发现，一定浓度的纳米颗粒进入水体后会对水生生物，如斑马鱼肝组织的生长代谢相关基因产生了不良影响，说明超过一定浓度的纳米材料能产生生物学效应22，破坏一些生物的正常代谢，但由于本实验研究面不广、涉及面不深，所以无法得出如何浓度下的纳米积累会给环境带来影响，或者纳米材料的自然降解的周期，因此只能说纳米材料使用需谨慎。参考文献1单志强纳米材料特性极其在环境保护领域的应用J环保材料,2005,2324262李泉,曾广斌纳米粒子J化学通报,1995,6293熊道文,李政,方涛纳米材料的水生态毒理学研究进展J环境污染与防治

20、,2009,3144NATIONALRESEARCHCOUNCIL2002SMALLWONDERS,ENDLESSFRONTIERSAREVIEWOFTHENATIONALNANOTECHNOLOGYINITIATIVEPP12WASHINGTON,DC,NATIONALACADEMYPRESS5PENTTINENP,TIMONENKL,TIITTANENP,ETALULTRAFINEPARTICLESINURBANAIRANDRESPIRATORYHEALTHAMONGADULTASTHMATICSEURRESPJ,2001,1734284356GRAZYNABP,GOLIMOWSKIJ,P

21、AWELLURBANNANOPARTICLESTHEIRPOTENTIALTOXICITY,WASTEANDENVIRONMENTALMANAGEMENTJWASTEMANAGEMENT,2009,29258725957汤洪宵环境纳米材料及其生态风险J水处理信息报导,2006,63128CHENZ,MENGH,XINGGM,ETALACUTETOXICOLOGICALEFFECTSOFCOPPERNANOPARTICLESINVIVOJTOXICOLOGYLERE,2006,16321091209袭著革,林治卿纳米尺度物质对生态环境的影响极其生物安全性的研究进展与展望J生态毒理学报,13203

22、20810黄肖容,徐卡秋纳米氧化铝粉J精细化工概念,2008,1025525711王天成,孙红芳,贾光纳米氧化铝对小鼠血清生化指标的影响J中国职业医学,2006317217312祝琳,王国良鱼类HSP70的研究进展J宁波大学学报,2007400813刘迪秋,葛锋,陈朝银重金属铜镉对鲫肝脏基因表达的影响J中国水产科学,2010,1117614HARTLFHMOLECULARCHAPERONESINCELLULARPROTEINFOLDINGNATURE,1996,381658357158015SCHRODERH,LANGERT,HARTLFUETALDNAK,ANDGRPEFROMACELLUL

23、ARCHAPERONEMACHINERYCAPABLEOFREPAIRINGHEARINDUCEDPROTEINDAMAGEEMBOJ,1993,12114137414416穆宝忠,隋秀芳肿瘤多药耐药基因P糖蛋白及其耐药逆转的研究进展J临床医药实践,2010,4917FOJOAT,UEDEK,SLAMONDJETALEXPRESSIONOFAMULTIDRUGRESISTANCEGENEINHUMANTUMORSANDTISSUESJPROCNATLACADSCIUSA,1987,84126526918PERRYSF,SHAHSAVARANIA,GEORGALISTMETALCHANNELS,

24、PUMPS,ANDEXCHANGERSINTHEGILLANDKIDNEYOFFRESHWATERFISHESTHEIRROLEINIONICANDACIDBASEREGULATIONJOURNALOFEXPERIMENTALZOOLOGYPARTACOMPARATIVEEXPERIMENTALBIOLOGY,2003,300A1536219朱小山,朱琳,郎宇鹏人工纳米材料富勒烯（C60）低剂量长期暴露对鲫鱼的氧化伤害J环境科学,2008,4298568581120CHOIAJE,KIMAS,AHNJHINDUCTIONOFOXIDATIVESTRESSANDAPOPTOSISBYSILVERNANOPARTICLESINTHELIVEROFADULTZEBRASHAQUATICTOXICOLOGY,2009,81915115921范维珂,赵涌肿瘤的治疗与药物敏感性M人民卫生出版社,200522MARINELLAF,JOSEPS,DAMIBANALYSISANDASSESSMENTOFTHEOCCURRENCE,THEFATEANDTHEBEHAVIOROFNANOMATERIALSINTHEENVIRONMENTTRENDSINANALYTICALCHEMISTRY2011,2010,11014