凝溶胶蛋白对胃癌细胞的影响【毕业设计】.doc

1、本科毕业设计（20_届）凝溶胶蛋白对胃癌细胞的影响所在学院专业班级食品质量与安全学生姓名学号指导教师职称完成日期年月2目录0引言121材料和方法1311凝溶胶蛋白的NI柱纯化1312SDSPAGE电泳分析纯化情况1313培养基的配置14131准备和安装过滤器14132合成培养基的配制14133小牛血清的处理15134生长培养基的配制1514细胞培养1515MTT法测定凝溶胶蛋白对癌细胞的生长影响15151MTT的配制15152MTT染色与观察1516细胞凋亡荧光HOECHST33342/PI双染152操作要点1621细胞培养中要注意的事项1622MTT法测吸光度16MTT法又称MTT比色法，是

2、一种检测细胞存活和生长的方法。其检163实验结果和讨论1631凝溶胶蛋白的纯化17凝溶胶蛋白纯化电泳图见图1，图中由左至右四个泳道标号为1、2、3、4、5、6，分别为标准电泳1732MTT法测凝溶胶蛋白对胃癌细胞的影响17321MTT法测得凝溶胶蛋白处理胃癌细胞原始数据17322根据MTT法测得光照密度计算不同浓度凝溶胶蛋白溶液对胃癌细胞的抑制率1833荧光染色法检测凋亡细胞的形态学变化19选取的加入20G/ML凝溶胶蛋白溶液处理的胃癌细胞进行荧光染色实验，在荧光显微镜下可见，随着凝溶胶蛋白给药剂量的增加，呈亮蓝色细胞的比率逐渐增加，并呈剂量依赖关系，提示19致谢错误未定义书签。参考文献21附

3、录错误未定义书签。摘要凝溶胶蛋白GELSOLIN是凝溶胶蛋白超家族的成员之一，是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，许多研究发现凝溶胶蛋白（GELSOLIN）在多种肿瘤中表达明显降低。本实验在培养的胃癌细胞中加入凝溶胶蛋白，通过MTT（34，5二甲基噻唑22，5二苯基四氮唑溴盐）比色法和荧光染色法观察凝溶胶蛋白对胃癌细胞的作用，探究加入凝溶胶蛋白的胃癌细胞生长是否受到了抑制。结果显示，与未加入凝溶胶蛋白培养的胃癌细胞相比，加入凝溶胶蛋白培养的胃癌细胞中出现凋亡期的细胞和已死亡的细胞，表明凝溶胶蛋白对胃癌细胞的生长起到了抑制作用，且加入凝溶胶蛋白的浓度越大，抑制作用越明显。关键词凝溶胶蛋白；肌动蛋白结合

4、蛋白；肌动蛋白；MTT比色法；荧光染色ABSTRACTGELSOLINISONEOFMEMBERSOFTHEGELSOLINSUPERFAMILYANDISANIMPORTANTACTINBINDINGPROTEINMANYSTUDIESHAVEFOUNDTHATGELSOLININAVARIETYOFTUMORSWASSIGNIFICANTLYREDUCEDINTHISSTUDY,GASTRICCANCERCELLSINCULTUREBYADDINGGELSOLINWEREOBSERVEDBYMTT（34,5DIMETHYLTHIAZOL2YL2,5DIPHENYLTETRAZOLIUMBR

5、OMIDE）ASSAYANDFLUORESCENTSTAINING,ANDEXPLORETHEADDEDGELSOLINWHETHERGASTRICCANCERCELLGROWTHWASINHIBITEDTHERESULTSSHOWEDTHATCOMPAREDTOGASTRICCANCERCELLSWITHOUTGELSOLIN,CULTUREDCANCERCELLSBYADDINGGELSOLINAPPEAREDAPOPTOSISANDDEATH,WHICHINDICATINGTHATGELSOLINONGASTRICCANCERCELLGROWTHINHIBITIONPLAYED,ANDJ

6、OINEDTHEHIGHERTHECONCENTRATIONOFGELSOLIN,THEMOREOBVIOUSINHIBITIONKEYWORDSGELSOLINACTINBINDINGPROTEINACTIN；MTTCOLORIMETRYFLUORESCENCEDYEING0引言凝溶胶蛋白是一种普遍存在且进化高度保守的肌动蛋白结合蛋白。细胞能在特定的时间、空间调节肌动蛋白的聚合解聚过程。能与肌动蛋白结合兵调节其聚合解聚作用的一类蛋白统称为肌动蛋白结合蛋白1。目前，在生物界里已经发现几十个种类，凝溶胶蛋白是在其中探究的比较清楚的一个种类。且凝溶胶蛋白最早于1979年2在兔的肺巨噬细胞中发现，证

7、实了凝溶胶蛋白能以钙以来的方式调节肌动蛋白重组的功能，因而将这个蛋白命名为凝溶胶蛋白3。之后，人们在血小板细胞中4和血清中5也发现了此类蛋白。凝溶胶蛋白是细胞骨架蛋白的重要组成成分之一，生物活性和功能多种多样，在诸如细胞运动型、细胞骨架结构动力学重排过程中的信号转导、细胞凋亡的控制，甚至是肿瘤发生过程的调节等方面都发挥着重要作用6,7。凝溶胶蛋白由3个或者6个同源的结构相似的片段组成8。目前，已获得的大多数物种的凝溶胶蛋白有6个相似的结构域。肌动蛋白微丝的排列与组装受到大约100种肌动蛋白结合蛋白的调控。凝溶胶蛋白便是其中之一9。凝溶胶蛋白在多种类型细胞中也均有表达，在胚胎期肌肉表达量最多10

8、。凝溶胶以及家庭的其他切割蛋白，切断蛋白能够结合两种单体和聚合物肌动蛋白11。癌细胞的重要特征包括无序生长和高迁移能力是转移性，而这两个过程都涉及到细胞肌动蛋白骨架的解聚与重排。已报道凝溶胶蛋白在人类多种恶性肿瘤中表达明显降低，其表达水平与肿瘤大小、侵袭性生长等密切相关，如在人膀胱癌中，凝溶胶蛋白在6个膀胱癌细胞系和778的膀胱癌组织中表达缺失和明显降低12。人们对凝溶胶蛋白在肿瘤中表达明显降低的现象进一步进行了深入研究，发现将外源凝溶胶蛋白CDNA全长转入癌细胞系过表达后，可抑制肿瘤细胞的生长，降低肿瘤细胞的集落形成能力和裸鼠致瘤性13,14。重组腺病毒编码的野生型凝溶胶蛋白转入膀胱癌细胞系

9、后可以使细胞停滞于G2/M期，原位膀胱癌动物模型经ADGSN治疗后，肿瘤体积缩小了90，这些实验证据提示凝溶胶蛋白具有明显的肿瘤抑制作用15,16。细胞凋亡过程是半胱天冬酶所激活的，半胱天冬酶是一种在细胞凋亡期间大量出现的细胞核受动器蛋白酶。在活体外的实验环境下，凝溶胶蛋白是良好的CPP3培养基17,18。已知在哺乳动物中共有14种此类蛋白家族的成员，其中半胱天冬氨酸3是细胞凋亡过程中关键的执行分子之一，可以剪切细胞凋亡过程中的多种关键蛋白，其目标之一就是凝溶胶蛋白19。而且在凝溶胶蛋白基因敲除的小鼠神经元细胞中，缺氧引起的细胞凋亡作用的增强，支持了凝溶胶蛋白能抑制细胞凋亡的假设。磷酸磷脂酰肌

10、醇与凝溶胶蛋白的紧密结合，能够消除由凝溶胶蛋白介导的抑制细胞凋亡的作用，这说明了凝溶胶蛋白抑制凋亡的作用可能主要取决于它构象和与肌动蛋白结合的能力20。凝溶胶蛋白在细胞凋亡的多种病理过程中发挥了一定的作用。比如，在老年痴呆症中，淀粉样肽可以诱导线粒体的机能紊乱和半胱天冬酶的活化，从而之势神经元凋亡21。凝溶胶蛋白可以直接作用在肌动蛋白，对很多生理活动有着重要的影响。伴随着分子遗传学和体外分析技术的发展，对凝溶胶蛋白在各个领域也进行了广泛的试验来进行研究，但是凝溶胶蛋白对肌动蛋白的作用机制和调节作用并没有真正的了解完善。其对肌肉的功能性作用和作用的机制等都需要进行进一步的研究。成肌纤维细胞是主要

11、的伤口愈合和各种组织纤维中起细胞，在伤口的正常愈合中，成肌纤维细胞很短时间的纯在，可以促进收缩，加快结缔组织的生长，但是在纤维化病变的组织中，成肌纤维细胞却不能按时的从病变的地方退出来，导致细胞外的基质持续过量分泌，造成组织结构的重塑，最终功能衰竭，这种特征是组织的纤维化22，23。肌动蛋白作为一个重要的肌肉细胞收缩的蛋白，也是构成细胞骨架的主要成分，其表达量的多少能直接反应成肌纤维细胞的分化、增值及凋亡情况，而凝溶胶蛋白又在肌动蛋白纤丝聚合及解聚的动态变化中发挥重要的调节作用，因此研究凝溶胶蛋白对成肌纤维细胞的功能性作用具有重要的理论意义，可通过分子生物学技术阻断其分化、增殖的信号通路及基因

12、转录，通过药物或重组蛋白促进成肌纤维细胞的凋亡，抑制其分化和增殖，促其恢复转化前细胞表型，从而阻断纤维化进程，根治组织纤维化疾病24。这些问题的解决，不只是在分子的水平中预防并且治疗肿瘤有重要意义，而且通过研究凝溶胶蛋白对肿瘤细胞的影响，还可以开发新的抗癌药物和抗癌的食品，在预防肿瘤，防止癌症的发生上同样意义重大。在本实验中，通过在培养的胃癌细胞中加入凝溶胶蛋白，以MTT比色法和荧光染色法来观察其对胃癌细胞生长起到的影响。1材料和方法材料3000ML锥形瓶，250ML或500ML培液瓶，翻帽塞，饭盒，PH试纸，孔径022M的微孔滤膜，酒精灯，移液枪，离心管。药品NAH2PO4溶液，NACL溶液

13、，IMIDAZOLEPH80，30ACR/BIS，15MOL/LPH88TRIS，05MOL/LPH68TRIS，10SDS，10AP，TEMED，盐酸，无离子水，小牛血清，合成培养基RPMI1640或DMEM，青霉素，链霉素，NAHC03。修哈四氮唑蓝，HOECHST染色试剂盒，胃癌细胞株。仪器滤泵1套，滤器1套，蒸馏器，高压灭菌锅，离心机，磁力搅拌器，XSZD2型荧光显微镜，BIORAD680型酶标仪，DYY12型三恒电泳仪。11凝溶胶蛋白的NI柱纯化由于重组表达的凝溶胶蛋白是以可溶性的形式存在于细胞质中，所以采用NINTA，在非变性条件下进行分离纯化。具体过程如下1）菌体用LYSISBU

14、FFER（50MMNAH2PO4，300MMNACL，10MMIMIDAZOLE，PH80）悬浮，超声破碎仪破碎后，收集可溶性上清。2）NINTA离心后，用LYSISBUFFER洗涤两次。加入细菌可溶性上清，在冰上轻微混匀1H，使重组蛋白充分地与NINTA相作用。3）12，000G，离心10SEC后，NINTA用WASHBUFFER（50MMNAH2PO4，300MMNACL，40MMIMIDAZOLEPH80）充分洗涤两次，弃上清。4）12，000G，离心10SEC后，NINTA用ELUTIONBUFFER（50MMNAH2PO4，300MMNACL，250MMIMIDAZOLEPH80）洗

15、涤三次，上清为含有重组蛋白的洗脱液。12SDSPAGE电泳分析纯化情况1）安装玻璃板；2配置分离胶；按照表1中的顺序加入所需的溶液，加完TEMED后聚合反应开始，立刻混匀溶液灌胶。3灌胶；将分离胶灌至两层玻璃板之间的间隙中，注意要给浓缩胶流出一定的空间（齿梳长再加1CM）。然后用吸管在分离胶上覆盖一层异丙醇（丙烯酰胺浓度为10左右）或者是01SDS（丙烯酰胺浓度为8左右）。置于室温或者是37。4聚合完成后（约30MIN），用滤纸将覆盖液吸走，用去离子水清洗凝胶的顶部数次（3次）以去除为聚合的丙烯酰胺。再用滤纸将水吸走。5按照表1中的体积制备浓缩胶。6将浓缩胶直接灌装在聚合好的分离胶上，立即在其

16、中插入一块干净的齿梳，注意不要混入气泡。置于室温或者是37聚合30MIN左右。7聚合后，将齿梳取出，用去离子水将未聚合的丙烯酰胺清洗。表1SDSPAGE电泳的配置TAB1CONFIGURATIONOFSDSPAGEELECTROPHORESIS贮液分离胶（10）浓缩胶（5）30ACR/BIS67ML（335ML）083ML15MOL/LPH88TRIS5ML（25ML）05MOL/LPH68TRIS126MLWATER79ML（345ML）277ML10SDS02ML（01ML）005ML10AP200L（100L）50LTEMED8L（5L）5LTOTALVOLUME20ML（10ML）5M

17、L8安装电泳装置。9点样。每个样品上样10ML。10电泳。先在凝胶上加8V/CM电压，待染料前沿进入分离胶后将电压调节到15V/CM继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部，然后关闭电源。注这里的长度指的是分离胶和浓缩胶的总长。11卸下玻璃板，小心撬开玻璃板，标注凝胶的方向。12考马斯亮蓝染色和脱色将凝胶置于装有考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R2501G，250ML异丙醇，100ML冰醋酸，加650去离子水）大平皿中，摇床上过夜。第二天将凝胶置于脱色液（100ML甲醇，100ML冰醋酸，800ML去离子水）中脱色，第三天来观察结果。将结果在凝胶成像系统上扫描，保存结果。13培养基的配置组织培养使用的

18、培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清10。20。131准备和安装过滤器清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径022M的微孔滤膜，用布包装好，15磅20MIN进行高压灭菌处理。在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中

19、，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用滤泵做正压过滤，压力数字为2。过滤后要检查滤膜是否完好无损。132合成培养基的配制1）去离子水用蒸馏器进行重新蒸馏去除无机和有机杂质，制3000ML三蒸水。三蒸水应及时使用，如果放置一段时间，则使用前须高压处理15磅20MIN。2）待水温降至1530，加入合成培养基干粉，用磁力搅拌一定时间24H使之充分溶解。3）配制RPMLL640培养基时应通入适量C02或加入6MOLL盐酸调PH至60左右，这样才能充分溶解。4）加入一定量NAHCO，调节PH至70左右。5）加水至最终体积。6）在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250ML或500ML玻璃瓶中，用翻帽塞塞

20、紧瓶口。7）瓶口封好，4冰箱贮存RPMI1640培养基可以20贮存。133小牛血清的处理市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体。1）将血清加热至56并保持30MIN，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。2）处理后的血清贮存于4。134生长培养基的配制此次试验中用到的培养基需加入青霉素和链霉素。1培养基分装成小瓶100200ML以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。2按如下比例配制基本培养基占8090，小牛血清占1020。按1体积分数加入双抗贮存液青霉素链霉素，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100ML和100ML。14细胞培养在无菌操作室内，将癌

21、细胞株接种于含15小牛血清的培养基的培养瓶中，将培养瓶置于37C、5CO2培养箱中进行隔夜培养（12H）。15MTT法测定凝溶胶蛋白对癌细胞的生长影响151MTT的配制预先在50ML离心管加入20MLPBS，从中先吸取5001000LPBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ML离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用022M滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光避光袋或是黑纸、锡箔纸包住可长期保存于20度。按细胞培养板每孔需加10L计算，一般每96孔板约需1ML。152MTT染色与观察1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100

22、L,铺板使待测细胞调密度至100010000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2）5CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,在前一天下午铺板，次日上午加药,每孔100L,设35个复孔3）5CO2，37孵育1648小时，倒置显微镜下观察。4）每孔加入20LMTT溶液（5MG/ML，即05MTT），继续培养4H。5）终止培养，小心吸去孔内培养液。6）每孔加入150L二甲基亚砜（可以直接溶解，无需配制），置摇床上低速振荡10MIN，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490NM处测量各孔的吸光值。7）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓

23、度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）16细胞凋亡荧光HOECHST33342/PI双染表2细胞凋亡荧光HOECHST33342/PI双染试剂盒组分TAB2COMPONENTSOFTHEFLUORESCENTDOUBLESTAININGOFAPOPTOSISKITHOECHST33342/PI组分KGA212100ASSAYSHEOCHST33342染液10MLPROPIDIUMLODIDE（PI）500L10BUFFERA10ML1选取加入20G/ML凝溶胶蛋白溶液处理的胃癌细胞，在培养24H后，吸尽培养液，消化收集后，将105106个细胞悬浮于1ML培养基中，再加入10LHEOCH

24、ST33342染液，混匀，370C孵育515MIN；2）细胞于40C，5001000R/MIN离心5MIN弃去上清液；3）加入10MLBUFFERA工作液用双蒸水将10BUFFERA稀释10倍悬浮细胞，加入5LPI染液，室温避光放置515MIN后混匀；4）荧光显微镜观察HEOCHST33342用氪激光激发的紫外光，激发波长为352NM，发射波长为400500NM，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488NM，发射光波波长大于630NM，产生红色荧光。2操作要点21细胞培养中要注意的事项此次试验需要进行多天，每天需要对培养的胃癌细胞更换培养基。由于每一细胞株均有其特定使用且已

25、适应的培养基，所以在更换培养基时，要使用与前次相同的培养基。因此，在配置培养基时，要多做一些备用，以免试验后期培养基不够。此次试验需要进行胃癌细胞的体外培养，在细胞体外培养的过程中，混入杂菌会严重影响试验的结果。所以在实验过程中，包括培养基的保存过程，实验器材的准备过程，细胞的培养过程中，要对杂菌污染进行严格的控制。培养基灭菌后需密封保存，实验器材在使用前也要进行严格的灭菌处理。需要在无菌试验室进行胃癌细胞的培养。最大限度的控制杂菌污染。22MTT法测吸光度MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结

26、晶甲瓒（FORMAZAN）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490NM波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。因此，此次试验中选取,MTT法测定胃癌细胞的吸光度。但由于MTT有致癌性，所以在配置时要注意，带好透明的薄膜手套，避免MTT与皮肤直接接触。且MTT一般现用现配，过滤后4C避光保存两周内有效，或配制成5MG/ML保存在20度长期保存，避免反

27、复冻融，在实验中将MTT小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。在实验前把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，不能一次性配置太多，当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。3实验结果和讨论31凝溶胶蛋白的纯化凝溶胶蛋白纯化电泳图见图1，图中由左至右四个泳道标号为1、2、3、4、5、6，分别为标准电泳，凝溶胶蛋白溶液，上清液、沉淀、纯化后的上清液和纯化后的沉淀电泳。图1凝溶胶蛋白电泳图FIG1EECTROPHORESISOFGELSOLIN32MTT法测凝溶胶蛋白对胃癌细胞的影响321MTT法测得凝溶胶蛋白处理胃癌细胞原始数据本次MTT实验为每隔4H、8H、24H、

28、48H和72H测定一次，将取得的光照密度值列表整理。发现凝溶胶蛋白对胃癌细胞具有较强的抑制作用，当凝溶胶蛋白的浓度为20G/ML、2G/ML和02G/ML时，根据MTT法得出吸光度（OD）见表3（以CK表示不加入凝溶胶蛋白培养的胃癌细胞，作为对照组，以CK表示）。按表3数据做出不同浓度凝溶胶蛋白处理下细胞生长状况曲线，如图2。表3不同浓度凝溶胶蛋白处理下细胞吸光度值TAB3LIGHTDENSITYOFGASTRICCANCERCELLSINDIFFERENTCONCENTRATIONSOFGELSOLIN凝溶胶蛋白浓度CK20G/ML2G/ML02G/ML0H02360236023602364

29、H0268025502550248H028202560254023924H036803130289028148H05520389040104572H1196053208021022凝溶胶蛋白（GELSOLIN）图2不同浓度凝溶胶蛋白处理下胃癌细胞光照密度值FIG2LIGHTDENSITYOFGASTRICCANCERCELLSINDIFFERENTCONCENTRATIONSOFGELSOLIN322根据MTT法测得光照密度计算不同浓度凝溶胶蛋白溶液对胃癌细胞的抑制率由表3可以看出，凝溶胶蛋白溶液对胃癌细胞生长具有抑制作用。则可以根据公式胃癌细胞存活率凝溶胶蛋白药物组光密度值/细胞对照组光密度

30、值100，抑制率100存活率。来计算不同浓度凝溶胶蛋白溶液对培养的胃癌细胞的抑制率，见表4根据得出的抑制率数据，做出不同浓度凝溶胶蛋白处理下的胃癌细胞抑制率曲线如图3。表4不同浓度凝溶胶蛋白对胃癌细胞的抑制率TAB4DIFFERENTCONCENTRATIONSOFGELSOLININHIBITIONRATEOFGASTRICCANCERCELLS凝溶胶蛋白浓度20G/ML2G/ML02G/ML4H48548510458H922993152424H14952147236448H29532736184872H555232941455不同时间、不同浓度凝溶胶蛋白处理下MGC803生长曲线00204

31、060811214048244872时间（H）胃癌细胞吸光值（OD492）CK20G/ML2G/ML02G/ML图3不同浓度凝溶胶蛋白处理下的胃癌细胞抑制率FIG3DIFFERENTCONCENTRATIONSOFGELSOLININGASTRICCANCERCELLSTREATEDWITHINHIBITORYRATE根据图2和图3可以看出，加药组的细胞生长受到明显的抑制，在处理72H后，加入20G/ML、2G/ML和02G/ML凝溶胶蛋白溶液的胃癌细胞抑制率分别为5552、3294、1455。可以得出，凝溶胶蛋白对胃癌细胞有抑制作用，且凝溶胶蛋白浓度在02G/ML到20G/ML范围内时，凝溶

32、胶蛋白溶液浓度为20G/ML时，对胃癌细胞的抑制最为明显。33荧光染色法检测凋亡细胞的形态学变化选取的加入20G/ML凝溶胶蛋白溶液处理的胃癌细胞进行荧光染色实验，在荧光显微镜下可见，随着凝溶胶蛋白给药剂量的增加，呈亮蓝色细胞的比率逐渐增加，并呈剂量依赖关系，提示凝溶胶蛋白可以诱导胃癌细胞凋亡。图4中A和B为未加入凝溶胶蛋白溶液培养的胃癌细胞荧光染色图，C和D为加入凝溶胶蛋白溶液培养的胃癌细胞荧光染色图。细胞凋亡荧光HOECHST33342/PI双染中，正常活细胞为暗蓝色，处在凋亡期的细胞染色为亮蓝色，而已死亡的细胞染色为红色。正常生长细胞的形状规则，而凋亡期的细胞周围出现许多小泡状的凋亡体。

33、在在胃癌细胞的荧光染色显微图上可以看出，未加入凝溶胶蛋白的胃癌细胞生长正常，形状规则，基本无凋亡期和死亡细胞，而加入凝溶胶蛋白的细胞染色显微图中，可以看到亮蓝色的细胞周围出现凋亡体处于凋亡期的细胞明显增多，甚至出现死亡了的胃癌细胞细胞。证明凝溶胶蛋白影响了胃癌细胞的生长，促使了胃癌细胞的凋亡。不同时间、不同浓度凝溶胶蛋白溶液处理的MGC803的增殖抑制率010203040506048244872时间H增殖抑制率20G/ML2G/ML02G/ML图4细胞凋亡荧光HOECHST33342/PI双染图FIG4FLUORESCENTDOUBLESTAININGCELLSHOECHST33342/PI凝

34、溶胶蛋白作为一种细胞骨架调节蛋白通过对肌动蛋白微丝骨架的调节效应使其与细胞的运动、形态改变、生长调控及凋亡等重要的生物功能联系起来,因此在许多生理和病理环境中发挥着重要的作用22细胞周期与肿瘤细胞的生长、增殖、分化等有密切关系9,10,肿瘤细胞是增殖失控细胞,不断地增殖,最终导致机体的死亡。如果细胞周期不能正常运转,就会导致遗传性能紊乱、增殖分化异常和细胞癌变,甚至导致死亡23。此次试验中发现，加入凝溶胶蛋白溶液培养的胃癌细胞，多数进入了凋亡期，甚至有些胃癌细胞已经死亡。说明，凝溶胶蛋白阻止了细胞周期的正常运转，使得胃癌细胞的增殖异常。得出凝溶胶蛋白在体外具有明显的抗癌活性的结论。此次实验的M

35、TT结果显示，凝溶胶蛋白在浓度在02G/ML至20G/ML的区间内，对胃癌细胞的生长均有抑制作用，且剂量越大，抑制作用越明显。通过荧光染色实验可以发现，凝溶胶蛋白阻断了细胞周期的正常运转，使得胃癌细胞增殖速度逐渐减慢甚至终止，也能说明凝溶胶蛋白对胃癌细胞有着抑制作用。综上所述,本文通过体外实验证明了凝溶胶蛋白具有明显的抑制肿瘤细胞生长活性，因此其有可能成为一种新型的抗癌药物或通过转基因技术将可产生凝溶胶蛋白的基因片段插入到其它动植物细胞中，从而生产出可抗癌的转基因食品。参考文献1韩晓曦，王继红，李庆伟凝溶胶蛋白的结构与功能J中国生物化学与分子生物化学报，2007，23（5）3313372LEE

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37、INOVERLAYOFPOLYACRYLAMIDEGELSJJCELLBILO，1981，90（3）8098125HARRISHE，BAMBURGJR，WEEDSAGACTINFILAMENTDISASSEMBLYINBLOODPLASMAJFEBSLETT，1980，121（1）1751776MCGOUGHAM，STAIGERCJ，MINJK，ETALTHEGELSOLINFAMILYOFACTINREGULATORYPROTEINSMODULARSTRUCTURES，VERSATILEFUNCTIONSJ，FEBSLETT，2003，552（23）75817王旭涛，张新超凝溶胶蛋白和危重病

38、JCHINESEGENERALPRACTICE，2009，12（11）208820918SILACCIP，MAZZOLAIL，GAUCIC，ETALGELSOLINSUPERFAMILYPROTEINSKEYREGULATORSOFCELLULARFUNCTIONSJCELLMOLLIFESCI，2004，611920261426239汪勇沛，詹永乐日本血吸虫凝溶胶蛋白基因在虫体不同发育阶段的转录水平分析上海畜牧兽医通讯，2010，1484910汪勇沛，詹永乐日本血吸虫凝溶胶蛋白基因在虫体不同发育阶段的转录水平分析上海畜牧兽医通讯，2010，1484911JEANNEFEINBERG,MARI

39、ECHRISTINELEBART,YVESBENYAMIN,ANDCLAUDEROUSTANLOCALIZATIONOFACALCIUMSENSITIVEBINDINGSITEFORGELSOLINONACTINSUBDOMAINIIMPLICATIONFORSEVERINGPROCESSBIOCHEMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMMUNICATIONS233,6165199712孟宪敏，曹慧青，王震等NELIN的肌动蛋白结合特性及与其相互作用蛋白质的筛选J科学通报，2004，49（21）2173217713江奇峰，蔡绍皙，晏小清，等钙调蛋白结合蛋白及其磷酸化对癌细

40、胞迁移能力的影响研究J生物化学与生物物理进展，2010，37332633614徐国恒细胞骨架肌动蛋白纤维J生物学通报，2005，4024315倪晓光凝溶胶蛋白的结构和功能及其抑制肿瘤的作用J实用癌症杂志，2007，22110510716TANAKAM,MULLAUERL,OGISOY,ETALGELSOLINACANDIDATEFORSUPPRESSOROFHUMANBLADDERCANCERJCANCERRES,1995,5515322817DAVIDJKWIATKOWSKIFUNCTIONSOFGELSOLINMOTILITY,SIGNALING,APOPTOSIS,CANCER18KAM

41、ADAS,KUSANOH,FUJITAH,OHTSUM,KOYARC,KUZUMAKIN,TSUJIMOTOYACLONINGMETHODFORCASPASESUBSTRATESTHATUSESTHEYEASTTWOHYBRIDSYSTEMCLONINGOFTHEANTIAPOPTOTICGENEGELSOLINPROCNATLACADSCIUSA1998,958532853719PHILCHENKOVAACASPASESASREGULATORSOFAPOPTOSISANDOTHERCELLFUNCTIONSJBIOCHEMISTRYMOSC，2003，68436537620MEJILLANO

42、M,YAMAMOTOM,ROZELLEAL,ETALREGULATIONOFAPOPTOSISBYPHOSPHATIDYLINOSITOL4,5BISPHOSPHATEINHIBITIONOFCASPASES,ANDCASPASEINACTIVATIONOFPHOSPHATIDYLINOSITOLPHOSPHATE5KINASESJJBIOLCHEM,2001,27631865187221QIAOH,KOYARC,NAKAGAWAK,ETALINHIBITIONOFALZHEIMERSAMYLOIDBETAPEPTIDEINDUCEDREDUCTIONOFMITOCHONDRIALMEMBRANEPOTENTIALANDNEUROTOXICITYBYGELSOLINJNEUROBIOLAGING,2005,26684985522YAMAGUCHIH,CONDEELISJREGULATIONOFTHEACTINCYTOSKELETONINCANCERCELLMIGRATIONANDINVASIONJBIOCHIMBIOPHYSACTA,2007,1117564265223张广美,姜梅,王春梅,李文超白桦酯醇对SKOV3肿瘤细胞调亡作用的影响J中华中医药学刊，2010，28918091811