牛皮胶原蛋白酶解条件优化【毕业设计】.doc

1、本科毕业设计（20_届）牛皮胶原蛋白酶解条件优化所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1前言32材料与方法321材料与仪器3211材料3212主要仪器和设备422方法4221测定方法42211酶活力的测定42222水解度的测定4222试验方法52221酶解用酶种类的选择52222酶解工艺优化53结果与讨论531蛋白酶活力的测定532酶解用酶的选择633木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的工艺条件优化7331木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的单因素试验73311酶解温度的确定73312酶解PH的选择73313酶解时间的选择83314木瓜蛋白酶加酶量的选择9332木瓜蛋白酶酶解牛

2、皮胶原蛋白的正交试验934复合酶酶解工艺优化10341复合蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的单因素试验113411加酶量的选择113412PH值的选择113413酶解温度的选择123414酶解时间的选择12342复合酶酶解牛皮胶原蛋白正交试验134结论14致谢错误未定义书签。参考文献14摘要本文研究了酶解法提取牛皮胶原蛋白小分子肽的工艺条件。以牛皮胶原蛋白的水解度作为指标，分别研究木瓜蛋白酶和复合蛋白酶对牛皮胶原蛋白的酶解效果，通过采用单因素试验和正交试验得到优化的工艺条件。正交试验表明，两种酶分别酶解时，酶解时间、温度、PH值、加酶量对牛皮胶原蛋白水解度的影响顺序均为温度PH值加酶量时间；木瓜蛋白酶酶

3、解的优化条件是温度55。C、PH值65、时间6H、加酶量6000U/G，在该优化条件下牛皮胶原蛋白的水解度可以达到231；复合蛋白酶酶解的优化条件是温度55。C、时间8H、PH值80、加酶量8000U/G，在该优化条件下牛皮胶原蛋白的水解度可以达到359。复合蛋白酶的对牛皮胶原蛋白的酶解效果优于木瓜蛋白酶。关键词胶原蛋白；胶原肽；酶解法；水解度ABSTRACTTHISESSAYSTUDIESONTHEEXTRACTIONCONDITIONSOFCOWHIDECOLLAGENSMALLPEPTIDESUSINGENZYMATICMETHODUSINGDEGREEOFHYDROLYSISOFCOW

4、HIDECOLLAGENASINDICATORS,STUDYTHEENZYMATICEFFECTCAUSEDBYPAPAINANDCOMPLEXPROTEASERESPECTIVELYANDTHENDERIVEOPTIMIZEDCONDITIONSBYSINGLEFACTOREXPERIMENTANDORTHOGONALEXPERIMENTORTHOGONALEXPERIMENTSHOWSTHATWHENTWOENZYMESWORKINGRESPECTIVELY,THEORDEROFINFLUENCECAUSEDBYENZYMOLYSISTIME、TEMPERATURE、PHNALUEANDA

5、DDINGQUANTITYOFENZYMEONHYDROLYSISDEGREEOFCOWHIDECOLLAGENTEMPERATUREPHVALUEADDINGQUANTITYOFENZYMETIMETHEOPTIMIZEDCONDITIONSOFPAPAINENZYMOLYSISISTEMPERATUREOF55、PHVALUEOF65、TIMEOF6H、ENZYMECONCENTRATIONOF6000U/GANDUNDERTHISCONDITIONTHEHYDROLYSISDEGREEOFCOWHIDECOLLAGENCANACHIEVE231THECOMPLEXPROTEASEENZY

6、MOLYSISCONDITIONISTEMPERATUREOF55、TIMEOF8H、PHVALUEOF80、ENZYMECONCENTRATIONOF8000U/GANDUNDERTHISCONDITIONTHEHYDROLYSISDEGREEOFCOWHIDECOLLAGENCANACHIEVE359THEENZYMOLYSISEFFECTCAUSEDBYCOMPLEXPROTEASEISBETTERTHANTHATOFPAPAINKEYWORDSCOLLAGENCOLLAGENPEPTIDEENZYMATICDEGREEOFHYDROLYSIS1前言我国是皮革生产大国之一，每年生产30万

7、吨以上的皮革废渣，利用这些工业废弃物酶解来制备胶原多肽，使其变废为宝，不仅减少环境污染，还能带来良好的社会效益和经济效益。但是由于酶自身的缺点，如高度的底物专一性，易变敏感性，水解率偏低等，导致工业化生产的成本较高，产品价格昂贵。所以寻找热稳定性好的胶原蛋白酶，改进各种水解工艺条件，提高胶原蛋白酶解为胶原多肽的酶解效率，将成为水解胶原蛋白领域的研究重点1。由于胶原多肽具有良好的营养功能、理化性能以及生理功能，所以它的应用范围非常广泛。随着年龄的增长，人体对能量的需求量呈下降趋势，但单位体重氮的需求量并不下降，老年人可通过摄入胶原多肽来克服这一矛盾25。由于胶原多肽具有保护胃粘膜抗溃疡、抑制血压

8、上升、提高骨骼强度、促进皮肤胶原代谢等功能，同时酶解胶原蛋白制备的胶原多肽具有更小的相对分子质量,并且更易降解,所以在营养保健品和日用化学品开发方面拥有一定的市场，可将其开发成各种美容护肤品、美容饮料或降血压、预防骨质疏松等的功能保健品67。除此之外胶原多肽还可应用于运动保健食品中，实验证明由于肤在胃中排空及小肠吸收快，负氮平衡及由此产生的肌肉分解代谢阶段将进一步缩短或消失，胶原水解物可作为在运动或运动结束时的恢复性饮料710。由于蛋白水解物属于高蛋白低热量物质，还可应用于减肥食品。胶原蛋白是一类结构相关的蛋白质家族，广泛存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极其主要的

9、结构蛋白，起着支持结构器官、保护机体的作用1014。胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，三条链相互平行而且由链间氢键相连，具有十分稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难使其分解，因此难被人体吸收，食用利用率较低1519。将胶原蛋白水解为胶原多肽后，其营养及生理功能可显著提高蛋白质消化吸收率几乎达100，能保护胃黏膜以及抗溃疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，对关节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用，能促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等。因此，胶原蛋白的水解及胶原多肽的利用一直是一个热门课题20。本文主要介绍了酶解条件（温度、PH、酶解时间、加酶量）对胶原蛋白水解度的影响，以及研究木瓜蛋白酶和

10、复合蛋白酶对牛皮胶原蛋白酶解的最优条件，从而得到有较高水解度的酶解用酶和酶解条件21。2材料与方法21材料与仪器211材料牛皮胶原溶液以新鲜牛皮为原料、对牛皮进行去脂、去杂，以05MOL/L的乙酸为提取介质，采用胃蛋白酶酶解，提取液经过过滤初步分离得。胃蛋白酶生物试剂上海源聚生物科技有限公司木瓜蛋白酶生物试剂上海源聚生物科技有限公司胰蛋白酶生物试剂上海源聚生物科技有限公司复合蛋白酶生物试剂广西东恒华道生物科技有限公司氢氧化钠分析纯国药试剂干酪素化学试剂广东医药站化学试剂综合公司乙醇分析纯国药试剂其它均为实验室常规试剂212主要仪器和设备DKS22型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司TDL5

11、台式低速大容量离心机江苏金坛市医疗仪器厂分光光度计北京普析通用仪器有限公司PHS25型数显PH计上海精密科学有限公司其它为实验室常用设备22方法221测定方法2211酶活力的测定福林酚法，按照SB/T103171999测定2222水解度的测定水解度（DH）的定义在水解过程中降解的肽键占蛋白质肽键总数的百分比。当蛋白质全部水解生成游离氨基酸时，DH100；未水解时，DH022。甲醛定位滴定法，测定原理甲醛固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用酸度计对电位的变化进行定量测定，根据PH值判断和控制滴定终点。操作步骤1将酶解液在4000R/MIN下离心10MIN，吸取5ML上层清置于100ML容量瓶中，

12、加蒸馏水至标线吸取200ML上述溶液于烧杯中，加60ML蒸馏水，1酚酞指示剂02ML；用01M氢氧化钠标准液滴定至刚显微红色PH值约82记录消耗氢氧化钠的体积V1；2加入50ML37中性甲醛溶液（甲醛溶液先用氢氧化钠滴定至82），混匀。再用01M氢氧化钠标准溶液继续滴定至深红色PH值约85记录消耗氢氧化钠的体积V2；3另取一不加入蛋白酶，其它条件完全一样，作为对照试验；水解度蛋白水解后消耗的NAOH体积（ML）蛋白未经水解消耗的NAOH体积（ML）蛋白彻底水解所耗的NAOH体积（ML蛋白未经水解所耗的NAOH体积（ML）222试验方法2221酶解用酶种类的选择选取复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白

13、酶、胰蛋白酶，按每克胶原溶液选择相同的酶活力单位，在各自最适的酶解条件下进行酶解，以水解度为主要指标，确定两种比较适宜的水解用酶对胶原蛋白进行酶解。2222酶解工艺优化对选定的两种用酶先进行单因素试验研究，以水解度为主要指标。分别参考加酶量、温度、PH值、时间对水解度的影响。再在单因素试验的基础上选择通过正交试验的方法，以水解度DH为指标，优化酶解条件。3结果与讨论31蛋白酶活力的测定按照SB/T103171999的方法，绘制酪氨酸标准曲线，结果如图31所示。FIG31TYROSINESTANDARDCURVE以每分钟水解酪蛋白产生1G酪氨酸为1个蛋白酶活力单位，测定样品吸光值，再通过图31标

14、准曲线上找出相应的酪氨酸浓度，最后计算出蛋白酶活力，实验测得所选用的几种蛋白酶活力测定的结果见表31所示。表31蛋白酶活力的测定结果TAB31THEMEASUREDRESULTSOFPROTEASEVIGOR酶种类缓冲液酶活力U/G胃蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶复合蛋白酶PH25乳酸缓冲液PH72磷酸缓冲液PH100硼砂氢氧化钠缓冲PH65磷酸缓冲液39610313110413910476510432酶解用酶的选择参照各种酶的使用说明书。分别在选择的几种酶的适宜条件下酶解2H，以水解度为主要指标，确定最适的水解用酶。其中胶原浓度料液比选择120，浓度太大的话会形成粘稠的胶原粘液，不利于酶解的进行。

15、因此本文所有的酶解底物浓度均为120，不再对底物浓度进行单独分析。水解度的测定按照甲醛定位滴定法，结果见表32所示。表32不同酶对牛皮胶原的酶解效果TAB32DIFFERENTENZYMESCOLLAGENENZYMESOLUTIONOFCOWHIDEEFFECT酶种类加酶量（U/G）时间（H）温度（）PH值水解度DH（）胃蛋白酶40002372731木瓜蛋白酶400026060132胰蛋白酶40002507592复合蛋白酶400025580194从表32中可以看出，三种酶对牛皮胶原的水解效果为复合蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶胃蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的要明显高于胰蛋白酶和胃蛋白酶。其中复合蛋白酶跟

16、木瓜蛋白酶水解效果要明显高于另外两种酶。复合蛋白酶一般由枯草杆菌深层液体发酵产生，经浓缩提取精制复合而成，是一种杆菌蛋白酶的复合体。此外，也有根据生产或研究直接对蛋白酶进行复配而成的复合酶。复合酶与其它单一的酶比较，其组成成分更为复杂，酶切位点也更多，因而其对底物的适应性要更强。木瓜蛋白酶一般由种植的番木瓜未成熟果实中割取乳液经采用生物技术提取、微滤、超滤、冷冻干燥提炼而得。木瓜蛋白酶具有较强的蛋白酶水解能力，还还具有凝乳、解脂和溶菌活力，是一种能作用于各类蛋白质的纯天然产物。并且具有耐高温、活性强、稳定性好、蛋白质水解能力强等特性，此外对PH变化不是很敏感，因此应用比较广泛。从本试验结果来看

17、，木瓜蛋白酶对牛皮胶原的作用也比较强，其中水解度DH132，高于胰蛋白酶和胃蛋白酶。根据实验结果综合考虑，本实验选择木瓜蛋白酶和复合蛋白酶作为牛皮胶原酶解的水解用酶。33木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的工艺条件优化331木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的单因素试验3311酶解温度的确定分别用五个三角瓶各取100ML牛皮胶原溶液，调节初始PH至60，酶用量为4000U/G，在温度分别为45、50、55、60、65条件下，提取4H测定其水解度，考察温度对木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原的影响。实验结果见图3111所示FIG3111THEINFLUENCEOFTEMPERATUREONHYDROLYSISDEGREE温

18、度对酶解反映的影响比较复杂，不但能影响水解反应的速度，还能直接影响酶的活力。从图1中可知，当水解温度低于55时，随温度的增加牛皮胶原的水解程度增加；当在55和60之间时水解程度变化不是很明显；当大于60时，水解度反而有所下降；分析可能是温度升高导致木瓜蛋白酶活力降低。在55时候，木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原有较高的水解度。3312酶解PH的选择分别用五个三角瓶各取100ML牛皮胶原溶液，加酶量为4000U/G、温度60的条件下水解4H，调节初始PH值分别为45、50、55、60及65，考察PH值对水解度的影响。结果见表2所示FIG2THEINFLUENCEOFPHONHYDROLYSISDEGREE

19、PH值得大小直接影响酶的活力，每一种酶都有其适宜的PH值范围。从图2可知，当PH值小于60时，水解度随PH值的升高而增加；当PH值大于60时，水解度随PH值的升高而降低；PH值为60时，水解度较高。表明木瓜蛋白酶在PH值60时的弱酸性条件下对牛皮胶原蛋白的水解达到了一个较好的效果，在酸或过碱的环境下，木瓜蛋白么酶的活性会受到不同程度的抑制，此外，不适宜的PH环境还会影响酶与底物的结合，也会影响水解效果。因此选择PH60为木瓜蛋白酶水解牛皮胶原的酶解PH值。3313酶解时间的选择分别用五个三角瓶各取100ML牛皮胶原溶液，温度60，初始PH值为60，加酶量4000U/G，酶解时间分别取2H、4H

20、、6H、8H和10H，考察不同酶解时间对水解度的影响。结果见表3所示FIG3THEINFLUENCEOFTIMEONHYDROLYSISDEGREE一般蛋白质水解的水解度会随着作用时间的增加而增加；但是当达到一定的时间后，随底物浓度的下降、水解产物的积累，水解度增加的程度会不再增加。因此，在工业生产中为提高经济效益，常常选择此时作为酶解作用时间。由图3可知，时间在6H内，随时间的延长，水解程度也不断的增加，但是当超过6H时，随着时间的延长，酶解程度几乎不再增加，在木瓜蛋白酶降解牛皮胶原蛋白时，宜选用6H作为酶解的作用时间。3314木瓜蛋白酶加酶量的选择分别用五个三角瓶各取100ML牛皮胶原溶液

21、，在前面几个单因素实验的基础上，选择PH60、温度60的条件下水解4H，以每克底物的酶用量分别为2000U/G、4000U/G、6000U/G、8000U/G、10000U/G考察加酶量对水解度的影响。结果如图4所示FIG4THEINFLUENCEOFADDENZYMEQUANTITYONHYDROLYSISDEGREE一般来说随蛋白酶用量的增加蛋白质的水解程度也随之增加；但是当水解到一定程度时，由于底物浓度的下降，蛋白质的水解度不会一直随酶用量的增加而增加。如图4所示，当木瓜蛋白酶酶用量6000U/G时，就可达到较好的水解效果。此后在增加用酶量水解度几乎不再变化。因此，木瓜蛋白酶加酶量的选择

22、应不超过6000U/G较为适宜。332木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的正交试验本实验的目的是通过单因素试验、正交试验的方法，以期得到酶解牛皮胶原蛋白的最宜条件，以水解度为主要指标，确定木瓜蛋白酶用于牛皮胶原蛋白酶解工艺条件。因素水平表见表1，按L9（34）正交表进行正交试验，正交试验的结果见表2。表1正交试验因素水平表TAB1THEFACTORSANDLEVELSOFORTHOGONALEXPERIMENT水平因素温度（）PH加酶量（U/G）时间（H）150552000225560400043606560006表2正交试验结果与分析TAB2THERESULTSANALYSISOFORTHOGONA

23、LEXPERIMENT试验号因素水解度（）温度（）PH加酶量（U/G）时间（H）15055200027925060400041123506560006129455554000619155560600021896556520004188760556000415986060200061609606540002163K110667143001423314367K218933153671553315300K316067160001590016000R8266170016671633从表52可知，四个因素对牛皮胶原蛋白水解的影响顺序为温度PH加酶量时间，优化所得的工艺条件为55、PH65、6000U/G

24、、6H。通过验证实验得，在该优化条件下，牛皮胶原蛋白的水解度可达到231。34复合酶酶解工艺优化341复合蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的单因素试验3411加酶量的选择参照实验所选用的复合酶说明书，在PH70、温度55、酶解时间6H，研究不同加酶量对水解度的影响。其结果如图5FIG5THEINFLUENCEOFADDENZYMEQUANTITYONHYDROLYSISDEGREE从图5可知，加酶量在200080000U/G范围内，随着加酶量的增加牛皮胶原蛋白的水解度也逐渐增加，但当加酶量大于80000U/G时，加酶量增加，水解度反而有所下降。可能是酶浓度太大，反而阻碍了酶与底物的结合，影响水解效率。因

25、此加酶量选择应不超80000U/G。3412PH值的选择加酶量为6000U/G，温度55、时间6H，考察不同PH对复合酶对牛皮胶原蛋白水解度的影响。结果见图6FIG6THEINFLUENCEOFPHONHYDROLYSISDEGREE从图6中可以看出，PH值对水解度的影响较大。PH的大小直接影响酶的活力。当PH值小于75时，随PH的升高水解度增加，当PH值大于75时，随PH的升高水解度降低，PH在78时，水解度较高。实验结果表明复合酶PH在78时对牛皮胶原蛋白的水解度效果较好，在过酸或国建的环境中，酶的活力会受到不同程度的影响，此外，不适宜的PH环境还会影响酶与底物的结合，影响水解效果。341

26、3酶解温度的选择酶用量6000U/G，PH值70、时间6H，考察不同温度对复合酶对牛皮胶原蛋白水解度的影响。结果见图7FIG7THEINFLUENCEOFTEMPERATUREONHYDROLYSISDEGREE从图中可知，酶解温度在5060时，复合酶对牛皮胶原蛋白的水解度效果较好在55时候达到最大值。3414酶解时间的选择加酶量6000U/G、PH为70、温度55，考察酶解时间对牛皮胶原蛋白水解度的影响。结果图8所示FIG8THEINFLUENCEOFTIMEONHYDROLYSISDEGREE从图8可知，牛皮胶原蛋白的水解度随着酶解时间的延长逐渐变大，当酶解8H后，达到最大值，此后延长酶解

27、时间，水解度不再增加。342复合酶酶解牛皮胶原蛋白正交试验与研究木瓜蛋白酶的方法一样，以水解度问主要指标，通过正交试验设计，确定复合蛋白酶用于牛皮胶原蛋白二步酶解工艺条件。按L9（34）正交表进行正交试验，因素水平表和实验结果分析表，分别见表1和2表1正交试验因素水平表TAB1THEFACTORSANDLEVELSOFORTHOGONALEXPERIMENT水平因素温度（）PH加酶量（U/G）时间（H）150640004255760006360880008表2正交试验结果与分析TAB2THERESULTSANALYSISOFORTHOGONALEXPERIMENT试验号因素水解度（）温度（）P

28、H加酶量（U/G）时间（H）150640004172250760006282350880008325455660008314555780006348655840004355760680006251860740008262960860004273K1259246263264K2339297289296K3262318308300R79724536从表2可知，四个因素对牛皮胶原蛋白水解度影响顺序为温度PH加酶量酶解时间，所得优化工艺条件为温度55、时间8H、PH为8、加酶量为8000U/G。通过验证实验得在该优化条件下，牛皮胶原蛋白的水解度可达到359。4结论（1）通过酶的选择实验，以牛皮胶原蛋白

29、的水解度为主要指标，选择了木瓜蛋白酶和复合蛋白酶作为酶解牛皮胶原蛋白的酶解用酶。（2）在单因素试验的基础上对两种酶的酶解工艺进行了优化。正交试验结果表明，木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的最适工艺条件为温度55、时间6H、PH为65、加酶量为6000U/G，通过验证实验，得到在该优化条件下，牛皮胶原蛋白的水解度可达到231。复合蛋白酶通过优化所得到工艺条件为温度55、时间8H、PH为8、加酶量为8000U/G，通过验证实验得，在该优化条件下，牛皮胶原蛋白的水解度可以达到359。（3）复合蛋白酶的酶解效果要优于木瓜蛋白酶。参考文献1蒋挺大,张春萍胶原蛋白M北京化学工业出版社,20012唐传核,彭志英一

30、种新型功能性食品基料胶原多肽J中国商办工业,2001544453蒋挺大胶原与胶原蛋白M北京化学工业出版社,2006501054宋晓燕,高彦祥,袁芳水解胶原蛋白的研究进展J中国食物与营养,2008232345赵胜年酶解鲜猪皮提取水解胶原蛋白的研究J食品工业科技,1998516176TNAGAI,NPREPARATIONANDPARTIALCHARACTERIZATIONOFCOLLAGENFROMPAPERNAUTILUSARGONAUTAARGO,LINNAEUSOUTERSKINSUZUKIJFOODCHEMISTRY,2002761491537TNAGAIETALCOLLAGENOFTHE

31、SKINOFOCELLATEPUFFERFISHJFOODCHEMISTRY,2002781731778李岩,班玉凤,郭洪臣等PH值渐变条件下双酶协同水解猪皮制备胶原蛋白寡肽的研究J食品科学,2003,24774799胡胜,李志强,陈敏猪皮胶原酶法提取J中国皮革,2003,3256810班玉凤,朱海峰ALCALASE水解猪皮胶原蛋白的研究J现代食品科技,2004,212596111曾名勇,李八方,陈胜军等红非鲫OREOCHROMISNILOTICUS鱼皮胶原蛋白酶解条件研究J中国海洋药物杂志,2005,245242912贾冬英,王文贤等胶原蛋白多肽功能特性的研究J食品科学,2001,22621

32、2413穆畅道,朱梅湘等利用皮边角料提取食品级胶原蛋白/多肽（）重要物理性质和微生物技术分析J中国皮革,2003,3215212414蒋挺大,张春萍胶原蛋白M化学工业出版社,200115菅景颖,张志胜酶解胶原蛋白研究进展J浙江化工,2007,381182016曹健,李卫林,张磊等酶解胶原蛋白产物分子量的控制研究J食品工业科技,2006,278858817李彦春,祝德义,侯立杰等酶解胶原蛋白多肽的制备与分析J中国皮革,2004,333222618蒋寅,翟青,郭桦等壳聚糖对锌铁离子的配位特性及其配合物的应用J现代食品科技,2007,239899119安广杰,徐清萍NEUTRASE蛋白酶降解骨胶原蛋白制备水解明胶J食品与机械,2007,523394020韩风杰,赵征酶法制取比目鱼皮胶原蛋白寡肽J食品研究与开发,2006,27810410721刘海英,李丁,李双祁等斑点叉为尾鲴鱼皮明胶水解方法的研究J食品工业科技,2007,28217617822徐英操,刘春红蛋白质水解度测定方法综述J食品研究与开发,2007,287173176