三疣梭子蟹蜕皮抑制激素基因的组织表达【毕业设计】.doc

1、本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹蜕皮抑制激素基因的组织表达所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录1引言12材料与方法221实验材料222实验试剂和引物223主要仪器224总RNA的提取225第一链CDNA合成326荧光定量PCR427相对定量处理43结果与分析431实验结果4311获得总RNA结果4312荧光定量PCR处理结果5313相对定量法处理结果632讨论84展望10致谢错误未定义书签。参考文献102摘要甲壳动物的蜕皮过程主要是由两种激素相互拮抗而进行调控的，分别是由Y器分泌的蜕皮类固醇激素和由X器窦腺复合体分泌的蜕皮抑制激素（MIH），其中MIH抑制Y器中

2、蜕皮激素的合成从而抑制蜕皮。MIH是其中一个重要激素，和血糖过多激素（CHH）、性腺抑制激素（GIH）组成了一个新的甲壳动物的神经肽家族，本文通过荧光定量PCR对三疣梭子蟹MIH基因的组织表达进行研究，然后用相对定量法进行分析，结果发现MIH在X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑、Y器中都能表达，但是和X器窦腺复合体相比，其他组织MIH的表达量极低。关键词三疣梭子蟹；蜕皮抑制激素；甲壳动物；X器窦腺复合体。ABSTRACTTHEPROCESSOFECDYSISOFCRUSTACEANSISANANTAGONISTICINTERACTIONBYTWOHORMONETHEYWEREECD

3、YSONEORIGINATESFROMTHEYORGANANDTHEMOLTINGINHIBITIONHORMONEMIHORIGINATESFROMXORGAN/SINUSGLANDXO/SGCOMPLEX,RESPECTIVELYAMONGTHEMMIHINHIBITSTHESYNTHESISOFECDYSTEROIDSBYYORGANSMIHISANIMPORTANTHORMONE,TOGETHERWITHCRUSTACEANHYPERGLYCEMICHORMONECHHANDGONADINHIBITINGHORMONEGIH,THEYCONSTITUTEANOVELFAMILYOFRE

4、LATEDPEPTIDESTHISARTICLEISTOSTUDYTHETISSUEEXPRESSIONOFMOLTINHIBITINGHORMONEGENEFROMPORTUNUSTRITUBERCULATUSTHROUGHFLUORESCENCEQUANTITATIVEPCR,USINGTHECOMPARATIVEDELTADELTACTTOANALYSISITASARESULT,ITFOUNDTHATMIHCANEXPRESSINALLORGANS,LIKEXORGAN/SINUSGLAND,THORACICGANGLIA,OVARY,TESTIS,GUT,BRAIN,YORGANHOW

5、EVER,COMPARINGTOXORGAN/SINUSGLAND,THEEXPRESSIONLEVELINOTHERORGANSISEXTREMELYLOWKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUS；MOLTINHIBITINGHORMONE；CRUSTACEAN；XORGANSINUSGLANDCOMPLEX。11引言三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS），属于甲壳纲梭子蟹科，是我国沿海地区的一种重要经济蟹类。因为它的生长迅速，再加上养殖利润丰厚，它已经渐渐成为中国沿海地区一种重要的养殖品种。三疣梭子蟹一般在35米深海底生活及繁殖，冬天它会移居到1

6、030米的深海中，它喜欢穴居在泥沙底部。近年来，随着各种虾蟹类在市场上需求的扩大和人们对虾蟹的过度捕捞，现有三疣梭子蟹的人工养殖也不能完全满足市场的需求。另一方面，人工养殖的三疣梭子蟹会出现抱卵过早1、蜕皮未遂2等问题。这些问题增加了三疣梭子蟹的养殖风险，制约了三疣梭子蟹市场的扩大。在甲壳动物中，因为实验仪器、技术的改进，对神经内分泌调控及其功能的研究越来越多，但是仍然不能有效的解决养殖中普遍存在的性早熟和蜕皮未遂等难题。进一步的研究发现，这些问题可能与甲壳动物的蜕皮机制密切相关。2所以研究清楚蜕皮机制对解决三疣梭子蟹存在的问题具有很重要的意义。ZELONY通过研究发现了眼柄在蟹的蜕皮周期中发

7、生作用，它可以使蜕皮间期缩短从而促进蜕皮，然后他们推测眼柄中肯定存在一种蜕皮抑制因子。在眼柄切除后，不仅仅使蜕皮周期缩短，同样产生了一些其他的生理生化反应，比如对生长和性腺发育产生影响。17,18所以我们可以推测在蟹的眼柄中肯定存在多种激素来调节它的生理生化反应。眼柄中的X器、Y器、大颚器都可以分泌一定的激素来影响蟹的生长发育。由X器窦腺复合体合成和分泌的MIH蜕皮抑制激素被认为是甲壳动物中涉及蜕皮控制的一个重要激素。现在的一个普遍接受的看法是甲壳动物的蜕皮过程主要是由两种激素相互拮抗而进行调控的，分别是由Y器分泌的蜕皮类固醇激素和由X器窦腺复合体分泌的MIH，而且MIH抑制Y器中蜕皮激素的合

8、成从而抑制蜕皮。WATSON在2001年通过研究证明了这个观点。所以MIH在甲壳动物的蜕皮中起着非常重要的作用。MIH的合成部位是甲壳动物的眼柄中的X器官，然后运送到窦腺中贮存并且由窦腺释放。近年来，通过从对MIH的研究可以发现，切除甲壳类动物眼柄就能有效的促进蜕壳和性腺的早期发育，而对上述手术后的动物重新注入眼柄分泌物或者MIH后，会使蜕皮激素浓度降低，同时推迟蜕皮。19近些年来，甲壳动物十足目中有很多物种的MIH序列已经被测定，例如凡纳对虾、刀额新对虾、日本对虾、黄道蟹等。对甲壳动物在蜕皮周期时在眼柄内编码产生的MIH进行NORTHEM印迹，我们可以发现编码MIH的MRNA水平在蜕皮前期逐

9、渐降低，最低点出现在蜕皮晚前期，在蜕皮后水平突然升高，在蜕皮间期持续升高，从而说明了MIH的生理功能。12现在甲壳类动物蜕皮的发生与MIH之间的关系还没有取得共识，MIH基因表达调控机理还没有得到阐明。所以研究更多的甲壳动物MIH是非常必要的。当前，国内外都有对蟹类MIH基因研究的报道，王在照等利用RTPCR得到鹰爪虾（TRACHYPENAEUSCURVIROSTRIS）MIH片段4，并对中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSIS）蜕皮抑制激素基因的CDNA片段进行克隆和序列分析10；他们运用还采用CDNA末端快速扩增RACE方法，首次得到中国对虾蜕皮抑制激素的全长CDNA；宋霞等运用反向

10、PCR技术得到了中华绒螯蟹的蜕皮抑制激素1基因组DNA序列5；邱高峰等用RTPCR技术首次扩增获得锯缘青蟹SCYLLASERRATA编码MIH成熟肽的全长CDNA序列及部分信号肽序列6；朱冬发等对三疣梭子蟹蜕皮抑制激素的CDNA进行克隆与序列分析7；LEE等人对可口美青蟹蜕皮周期中MIH的MRNA水平和蜕皮激素浓度的变化进行观察和分析11。虽然有对三疣梭子蟹MIH有一定的报道，但是相关的研究还是很少的。本研究通过对三疣梭子蟹MIH基因在不同组织中表达的分析，为今后更深入地研究MIH的功能奠定基础。在对MIH基因在不同物种的不同组织中的表达研究发现，在眼柄中MIH基因的表达量较高，而且在一些甲壳

11、动物的脑中也可以发现MIH基因少量表达13，然后在精巢、卵巢、肝胰腺和肌肉等组织中发现没有表达14、15。除了这些器官的研究，LU等用巢式PCR对食用黄道蟹（CANCERPAGURUS）2中其他器官的MIH基因的组织表达进行研究，发现在视神经、腹神经索和胸部或腹部的神经节都有MIH基因的表达16。本实验通过PRIMESCRIPTRTREAGENTKIT说明书上的方法获得X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑、Y器中MIH基因的CDNA的一条链，然后用荧光定量PCR法测定窦各个实验器官中的RNA含量，即MIH基因的表达量。以X器窦腺复合体的数据作为对照组，然后用2CT方法进行相对定量。最

12、后用图表定量的说明各个器官中MIH基因的表达情况。2材料与方法21实验材料在宁波宁海长街得水育苗场购得三疣梭子蟹。选取生长旺盛体重在4080G之间，头胸甲宽为812CM之间的三疣梭子蟹，然后取分别取出X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑、Y器组织，取出后迅速转移到液氮中保存。22实验试剂和引物DEPC（RNASEFREE），TRIZOL，购自SANGON公司加拿大；SYBRPREMIXEXTAQII，PRIMESCRIPTRTREAGENTKIT，DNASEI（RNASEFREE），引物合成是由上海英骏生物技术有限公司INVITROGEN完成；从TAKARA公司日本购得试剂盒。23主

13、要仪器（1）T1THERMOCYCLERPCR自动系列化分析仪德国BIOMETRA公司；（2）MICROMAX常温离心机；美国THERMO公司；（3）REVCD13863V型超低温冰箱美国REVCD公司；（4）HZ9211K恒温振荡器太仓市科教器材厂；（5）DYY8B型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂；（6）BIOFUGEFRESCO高速台式冷冻离心机美国SORVALL公司；（7）吉尔森可调精密移液器PEPETMAN法国GILSON公司；（8）TL988型实时荧光定量PCR仪；24总RNA的提取（1）超低温冷冻总RNA提取样品，称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，期间不断加入液氮直至研磨成粉状；（

14、2）向研钵中加入适量MRNAREAGANT将粉末状的样品覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，要用研钵继续研磨至透明状；（3）将匀浆液移至离心管中，室温静置50MIN；（4）在4，12000转的条件下离心5MIN；（5）小心吸取上清液，移入新离心管中；（6）将上述离心液加入200L氯仿，震荡，待充分乳化至乳白状，静置5MIN；（7）在4，12000转的条件下离心15MIN；（8）吸取上清液300L400L移至新的离心管中；（9）向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，在1530静置10MIN；（10）在4，12000转的条件下离心10MIN；（11）弃上清液，缓慢沿管壁加入75乙醇10

15、00L，轻轻上下颠倒洗涤，离心管壁，在4，12000转的条件下离心5MIN，后弃乙醇，干燥25MIN；（12）加入适量RNASEFREEH2O（大约2050L）325第一链CDNA合成（1）基因组DNA的除去反应试剂使用量5GDNAERASERBUFFER20LGDNAERASER10LTOTALRNA1RNASEFREEDH2OUPTO10L42下2MIN（或者室温5MIN2）4保存（2）反转录反应在冰上进行反应物的配置。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数1的量配制MASTERMIX，然后再分装到每个反应管中3。试剂使用量5PRIMESCRIPTBUFFER2（FORR

16、EALTIME）40LPRIMESCRIPTRTENZYMEMIXI10LRTPRIMERMIX410L251的反应液100LRNASEFREEDH2OUPTO20L537下15MIN685下5SEC47下保存1在20L的反应体系中可以使用的最大TOTALRNA是1G。2如果反应在室温下进行时时，可以将时间延长至30分钟。3不配制MASTERMIX，把添加剂加入的反应液中时，要先加入RNASEFREEDH2O和5PRIMESCRIPTBUFFER2FORREALTIME，将它们混合后再加入RTPRIMERMIX、PRIMESCRIPTRTENZYMEMIXI，然后轻轻混匀混合液进行反转录反应。

17、4使用RTPRIMERMIX可以高效合成CDNA。可以根据不同的实验目的，选择性的使用RTPRIMERMIX，也可以选择OLIGODTPRIMER或GENESPECIFICPRIMER进行反转录反应，引物使用量如下OLIGODTPRIMER50PMOL20L反应体系；GENESPECIFICPRIMER5PMOL20L反应体系。5根据不同的需求相应的扩大反应体系。6在使用GENESPECIFICPRIMER时，建议将反转录反应条件设置为42下转录15MIN。如果在PCR反应中有非特异性4片段扩增时，可以将温度升到50，这样会对反转录有一定的改善。7合成的CDNA需要长时间保存时，请于20保存。

18、26荧光定量PCR在MASTERCYCLEREPREALPLEXREALTIMEPCREPPENDORF上完成荧光定量PCR，总共25LPCR的反应体系，里面包含SYBRPREMIXEXTAQII2缓冲液125L，正向和反向引物10MOL/L各05L（参见表1），DH2O105L，CDNA模板1L。步骤是现在为95保持30S，进行一个循环，随后进行40个循环，每一循环包括955S，5530S，6830S。PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析，以确保特异性扩增，条件是9530S，55S，9515S1个循环，从55上升到95的过程耗时20MIN。实验结果采用仪器自带程序读取。表1内参基因与目的基

19、因的引物序列TABLE1PRIMERSEQUENCESFORINTERNALCONTROLGENESANDTARGETEDGENES基因引物序列预期产物大小BP18SRRNA5TTGGTGGAGCGATTTGTCTGG35AGAAGAAGCTGCGAACTGGAC3350ACTIN5CCTGACTGCCTACCTCACCAA35ATGCCGACAGATTCCATACCC3350MIH5GACGCTTTTCAGATCCGGCC35GCCTGTGCCAGTCGTCAGAGG311027相对定量处理我们采用2CT方法做相对定量，CTCT目的基因CT管家基因实验组CT目的基因CT管家基因对照组，计算实

20、验组目的基因的相对表达量。把18SRRNA作为内参基因。每个样品平均分析两次取平均值。把X器窦腺复合体的实验数据作为对照组的实验数据。然后根据数据作柱状分析图。3结果与分析31实验结果311获得总RNA结果在本次实验中我们进行GENOMICDNA污染的去除，因为此方法可以有效的获得MIH总RNA，（见图1）,总RNA浓度为7681158NG/L,OD260/280值为180205。28S18S58S12345图1总RNA凝胶电泳图FIG1RESULTOFTOTALRNAAFTERELECTROPHORESISIN1AGROSEGEL图中电泳条下面的数字代表不同的组织，我们选取了四个组织的总RN

21、A跑带，分别是X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢。根据图1我们可以看出凝胶电泳跑出的条带较清晰，降解较低。然后我们测其OD260/280值来确定其适宜性。凝胶电泳测得总RNA含量和OD260/280值见下表。表2总RNA含量和OD260/280值TABLE2THECONTENTOFTOTALRNAANDOD260/280VALUES总RNA总RNA含量（NG/L）纯度（OD260/280）11158180287419839262024768205由表2可以看出，总RNA含量达标，而且纯度也比较高，所以所提取的总RNA满足实验条件，可以进行下面的实验。312荧光定量PCR处理结果本实验采用相

22、对标准曲线进行定量分析，以18S和ACTIN为内参基因，对MIH基因在三疣梭子蟹不同组织中的相对表达进行了研究，各组样品在荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增，最后得到了反映核酸扩增过程的S形荧光定量动力学曲线。见图3。6图3扩增曲线动力学分析FIG3THEANALYSISOFAMPLIFICATIONPLOT图3表示不同实验组织和内参基因在荧光定量PCR中达到阈值所需要的循环数，自左向右分别表示Y器、精巢、脑、肠、卵巢、X器窦腺复合体、胸腹神经节、ACTIN基因、18S基因。达到阈值所需要的循环数越多，CT值越小。图4溶解曲线FIG4FUSIONCURVE从图4可以看出荧光定量动力学曲线基线平

23、整，扩增曲线比较理想。各基因样品熔解曲线都会有一个比较整齐的峰值，基线平整，熔解温度较均一，峰的形状也比较锐利。说明产物扩增具有特异性。从图4中分离出MIH的溶解曲线，见图5。从图5中看出熔解曲线的峰值比较完整，而且熔解度为875左右。图5MIH基因的溶解曲线FIG5FUSIONCURVEOFMIHGENE313相对定量法处理结果7表3相对定量处理结果（18S为内参基因）PROCESSINGRESULTSOFCOMPARATIVEDELTADELTACTREFERENCEGENEIS18S组织CT目的基因（MIH）CT管家基因（18S）CT2CTX器窦腺复合体283012990001胸腹神经节

24、2682771380071793647精巢34259829120001797242卵巢297480463900119239肠32008508190003424241脑33449578560002649618Y器362388312090000229376MIH基因MRNA的相对表达量（18S为内参基因）0020406081121234567图6MIH基因MRNA在各个实验器官中的相对表达量（18S为内参基因）FIG6COMPARATIVEEXPRESSIONLEVELOFMIHGENEINEXPERIMENTALORGANSREFERENCEGENEIS18S根据表3中的2CT做柱状图，得到图6

25、，图6中的数字代表的含义1、X器窦腺复合体；2、胸腹神经节；3、精巢；4、卵巢；5、肠；6、脑；7、Y器。表4相对定量处理结果（ACTIN为内参基因）PROCESSINGRESULTSOFCOMPARATIVEDELTADELTACTREFERENCEGENEISACTIN组织CT目的基因（MIH）CT管家基因（ACTIN）CT2CT8X器窦腺复合体2830279001胸腹神经节268222843580083620472精巢342523969890001053934卵巢297427591750297301779肠32001480168876387E06脑33442573731000630188

26、9Y器362327508330003107564MIH基因MRNA的相对表达量（ACTIN为内参基因）0020406081121234567图7MIH基因MRNA在各个实验器官中的相对表达量（ACTIN为内参基因）FIG7COMPARATIVEEXPRESSIONLEVELOFMIHGENEINEXPERIMENTALORGANSREFERENCEGENEISACTIN根据表4中的2CT做柱状图，得到图7，图7中的数字代表的含义1、X器窦腺复合体；2、胸腹神经节；3、精巢；4、卵巢；5、肠；6、脑；7、Y器。根据图6和图7中可以看出在X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑、Y器都有一定

27、的表达。当以ACTIN基因为内参基因，三疣梭子蟹的MIH基因以X器窦腺复合体为实验对照组时，胸腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑和Y器中MIH基因表达量都比对照组少，且精巢和肠中几乎检测不到MIH的表达量。X器窦腺复合体的MIH基因表达量是胸腹神经节表达量的12倍左右，是卵巢中MIH基因表达量34倍左右。当以18S为内参基因的时候，除胸腹神经节外，包括卵巢在内的MIH基因表达量都非常低。32讨论目前的研究发现在不同的物种间相同组织MIH基因的表达情况也不一样。有些物种在神经系统中能够表达，比如日本囊对虾、锯缘青蟹、刀额新对虾、可口美青蟹和锈斑蟳在胸神经节和脑中有表达6,13,16，但是在凡纳滨对虾中

28、就只发现在眼柄中有表达，而在胸神经节和脑中没有表达15。对三疣梭子蟹MIH基因组织表达的研究发现，其与大部分的虾蟹一样，在脑和胸神经节中都有表达。在X器窦腺复合体、精巢、卵巢、肠、Y器中也有表达，但是与X器窦腺复合体相比，其他组织中MIH基因的表达量都很低。9分析原因可能是与在其他蟹类中的研究有差异，原因可能是蟹类品种不同所致，也有可能是取的三疣梭子蟹的特异性的原因。因为我们取材的蟹类不是蜕皮周期中的三疣梭子蟹，而MIH最主要的作用是作用于Y器抑制蜕皮激素的产生从而抑制蜕皮，所以在非蜕皮时期，其他组织中的MIH含量低也是可能发生的。而且相对定量法得到的数据结果会有一定的误差，因为相对定量法假设

29、PCR的扩增效率为1，但是实际上的扩增效率达不到1。而且和绝对定量法比较，精确性不是很高。不过绝对定量法非常的费时费力，会大大的降低定量的效率，会增加其难度。作为三疣梭子蟹体内贮存MIH的器官，X器窦腺复合体对MIH有非常重要的作用，它贮藏X器官神经分泌细胞所产生的神经分泌物，并释放到血液中，是一个神经分泌系的末梢贮藏放出器。在X器中生成的MIH，可通过神经轴索而进入X器窦腺复合体。所以我们把X器窦腺复合体中MIH的表达量作为本次实验的对照组。有研究表明，锯缘青蟹的胸神经团和促雄腺具有直接的神经联系，也就是说锯缘青蟹促雄腺和胸神经团及相连的眼柄神经节等必然有着直接的相互作用关系。而且在神经器官

30、对性腺发育的作用的研究中发现脑和胸神经团对精巢发育也有一定的作用。可能原因是锯缘青蟹德的脑和胸神经团分泌的促性腺激素（GSH）先作用在促雄腺上，然后分泌促雄腺激素AGH，接着再作用于精巢，间接促进精巢发育。24三疣梭子蟹中MIH基因在胸神经节和大脑中的表达可能说明MIH也许和性腺发育相关。而表达量的差异也许与他们的作用大小有关。胸神经团和促雄腺具有直接的神经联系，而且促雄腺对精巢发育有促进作用，其中的主要原因可能是增加了精子数，从而加快了精荚形成的速度。沈建明等的研究表明，MIH可能与即将排出体外的精荚存在一定的联系。21本次实验在精巢和胸神经节中都发现了MIH的表达，而且在胸神经节中表达量很

31、高，我们可以推测MIH与即将排出体外的精荚存在一定的联系。当然，在这一方面我们还需要更多的研究来探究它们之间的联系。罗荣生等用20羟蜕皮酮注射中华绒螯蟹发现有刺激卵巢增重的作用25，说明蜕皮固酮对卵巢有作用，而作为蜕皮激素拮抗的蜕皮抑制激素，在卵巢中也应该表达。推测也有可能是两种激素的拮抗作用引发了卵巢增重。沈建明等的研究没有发现MIH基因在Y器中的表达21，但是本次实验中在Y器中发现了MIH基因的表达。而且我们可以从图6和图7中看出Y器中的表达量很小。分析原因可能是本次实验用了荧光定量PCR，可以测量微量的表达量。Y器作为MIH作用的靶器官，虽然实验材料不是在蜕皮期，但是也会有一定的表达量，

32、说明MIH不只是在三疣梭子蟹蜕皮的时候进入Y器的。在内参基因的选择上，由表3我们看出当以18S为内参基因时，X器窦腺复合体不适合做组织差异表达，由表4看出当以ACTIN为内参基因时，肠不适合做组织差异表达。而且实验结果显示，不管以18S作为内参基因还是以ACTIN为内参基因，当X器窦腺复合体中MIH基因的表达量作为对照后，其他组织中MIH基因的表达量都很低。总之，相对定量的精确性有待探讨，但是这不影响其精确测定组织中基因的表达与否，像在本实验中就发现在Y器中有MIH基因的表达。另一方面，MIH的表达在各种蟹类中都不同，在三疣梭子蟹中的组织表达也没有研究透彻，本次实验探索性的用荧光定量PCR后的

33、相对定量来研究三疣梭子蟹MIH基因的组织差异表达，为以后研究MIH在三疣梭子蟹在各个组织中的表达打下理论基础，同时也为在体外表达具有活性的MIH蛋白提供便利。104展望随着现代生物技术的不断发展，甲壳动物MIH的调控机制将会得到不断地验证与完善。针对甲壳动物更多的物种进行研究对于完善整个调控机制是至关重要的。近些年来，由于生物化学和分子生物学技术的成功应用，甲壳动物神经内分泌学的研究取得了很大进展。但目前其研究对象主要局限于几种模式动物，例如，普通滨蟹、美洲龙虾、泥污鲸螯虾和原螫虾等，而对其它动物研究较少。直到如今在生产上仍然采用传统的方法如切除眼柄、注射脊椎动物激素等调节一些经济种类的生殖活

34、动，所以我们应该扩大实验物种和实验方法。例如可以使用神经肽多克隆或单克隆抗体和分子生物学探针等。而且大多数激素在细胞内分子水平上的调控机制尚未完全清楚，如内分泌激素在细胞内的受体、与靶器官的作用模式、对靶器官合成通路上的酶的调控、在血淋巴中的半衰期、在不同的环境条件下及生活周期的不同阶段，释放激素的精确含量等。当然，对MIH的研究的进展必然会给我们带来巨大的现实意义和经济价值。参考文献1刘昌杰,侯艳丽,王纬等虾池养殖三疣梭子蟹当年性早熟初报J齐鲁渔业,19991619202赵润朝,史增奎南美白对虾半咸水一年双茬高效养殖技术J河北农业科技,20071413姚俊杰,赵云龙甲壳动物蜕皮的调节机制研究

35、进展J水利渔业,2006,2668104王在照,相建海编码鹰爪虾蜕皮抑制激素基因的CDNA片段的克隆和序列分析J水产学报,2002,2664874925宋霞,周开亚,马长艳中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1（ERSMIH1）基因组DNA的分子克隆和序列分析J动物学报,2004,50183906邱高峰,张爱萍,楼允东锯缘青蟹蜕皮抑制激素CDNA的分子克隆及其表达分析J水产学报,2003,2732072127朱冬发,沈建明,杨济芬等三疣梭子蟹蜕皮抑制激素CDNA的克隆与序列分析J动物学报,2008,546111211188王在照,焦传珍,张晓军等中国对虾蜕皮抑制激素全长CDNA的克隆及序列分析J遗传学报,2

36、003,3021281349宋霞,周开亚,马长艳中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1MIH1基因的CDNA片段克隆和NORTHERN印迹分析J中国水产科学,2003,10535335810王在照,相建海,崔朝霞编码中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因的CDNA片段克隆和序列分析J海洋与湖沼，2002，33（4）43243811KARAJLEE,RDOUGLASWATSONMOLTINHIBITINGHORMONEMRNALEVELSANDECDYSTEROIDTITERDURINGAMOLTCYCLEOFTHEBLUECRAB,CALLINECTESSAPIDUS199824962462712褚衍亮,姜乃澄,王玥甲

37、壳动物神经肽的结构和功能J东海海洋,2002,1424813CHANSM,CHENXG,GUPLPCRCLONINGANDEXPRESSIONOFTHEMOLTINHIBITINGHORMONEGENEFORTHECRABCHARYBDISFERIATUSJGENE,1998,22423331114CHENHY,WATSONRDMOLECULARCHARACTERIZATIONANDGENEEXPRESSIONPATTERNOFTWOPUTATIVEMOLTINHIBITINGHORMONESFROMLITOPENAEUSVANNAMEIJGENERALANDCOMPARATIVEENDOCR

38、INOLOGY,2007,151728115LEEKJ,KIMHW,GOMEZAM,ETALMOLTINHIBITINGHORMONEFROMTHETROPICALLANDCRAB,GECARCINUSLATERALISCLONING,TISSUEEXPRESSION,ANDEXPRESSIONOFBIOLOGICALLYACTIVERECOMBINANTPEPTIDEINYEASTJGENERALANDCOMPARATIVEENDOCRINOLOGY,2007,15050551316LUW,WAINWRIGHTG,OLOHANLA,ETALCHARACTERIZATIONOFCDNAENCO

39、DINGMOLTINHIBITINGHORMONEOFTHECRAB,CANCERPAGURUSEXPRESSIONOFMIHINNONXORGANTISSUESJGENE,2001,27814915917赵红霞甲壳动物蜕皮调控研究及蜕壳素的使用J广东饲料,2006,151323518殷海成眼柄切除对克氏原螯虾蜕皮、生长、性腺发育的影响J安徽农业科学,2007,35164818481919顾志敏,何林岗切除单侧眼柄对中华绒螯蟹蜕壳、生长、成熟的影响J淡水渔业,1991,5101320NAKATSUJIT,SONOBEHREGULATIONOFECDYSTEROIDSECRETIONFROMTH

40、EYORGANBYMOLTINHIBITINGHORMONEINTHEAMERICANCRAYFISH,PROCAMBARUSCLARKIAJGENCOMPENDOCRINOL,2004,135335836421沈建明,朱冬发,杨济芬等日本蟳蜕皮抑制激素基因的克隆及表达分析J经济发展方式转变与自主创新第十二届中国科学技术协会年会（第三卷）22李太武,张峰,苏秀榕三疣梭子蟹雄性生殖系统的组织学研究J辽宁师范大学学报自然科学版,1992，151293623李太武,赖伟,堵南山三疣梭子蟹雄性生殖系统的超微结构研究J华东师范大学学报自然科学版,1996,动物学专辑111624管卫兵,王桂忠锯缘青蟹促雄腺和胸腹神经团的直接联系J中国水产科学,2005,12439639925罗荣生,王幽兰,曹梅讯等中华绒螯蟹血淋巴20羟蜕皮酮诱发蜕皮和卵巢发作用动物学报,1990,362157164