RT-LAMP技术检测烟草环斑病毒的研究【开题报告】.doc

1、毕业论文开题报告食品质量与安全RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的研究一、选题的背景与意义烟草环斑病毒（TOBACCORINGSPOTVIRUS，TRSV）是中国进境检疫法规中明确规定禁止入境的危害性有害生物。该病毒寄主范围广，可侵染52科246种植物，是果树、蔬菜、花卉等经济作物的重要病害之一，发生严重时可导致绝产。中国进口的植物种球茎和苗木中携带该病毒的风险很大。国内外针对TRSV所用的检测技术主要有DASELISA和RTPCR技术。相比传统的电镜观察和生物学鉴定，这2种方法在检测周期方面具有明显的优势，操作快速简便和高通量。但是，DASELISA的检测周期仍然需要6H左右，且检测灵敏度相对

2、较低，假阳性较高；RTPCR的整个检测周期仍需4H左右，且需要特殊的PCR扩增设备、电泳设备和紫外成像设备，仪器昂贵，对人员技术能力要求较高，不利于技术向基层实验室的推广及现场检疫。环介导等温扩增技术（LAMPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATION,LAMP）作为一种新的核酸扩增方法，依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的BSTDNA酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。该方法扩增效率非常高，灵敏度高，特异性强，只要恒温水浴锅即可，扩增结果加入荧光染料后可用肉眼直接观察，无需特殊仪器，操作方便，对设备要求低，LAMP的整个反应

3、周期只需1525H，检测周期非常短。本研究的建立，将提供一种快速简便检测烟草环斑病毒的方法，使该病毒乃至动植物种的其他病毒、细菌及真菌的基层实验室检测和现场检疫成为可能。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题本研究旨在建立用RTLAMP技术检测植物中的烟草环斑病毒的方法。整个研究内容包括1、设计RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的引物序列；2、确定RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的最佳温度；3、确定RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的最佳反应时间；4、检验本研究设计的引物在植物病毒检验中的特异性；5、比较常规的RTPCR方法和本研究建立的方法检测烟草环斑病毒的灵敏度；6、检验用荧光染料SYBRGRE

4、ENI判断实验结果的准确性；7、检验本研究建立的方法在样品检验中的应用。三、研究的方法与技术路线针对本研究的内容设计研究方法和技术路线如下1、查阅文献，建立初步的烟草环斑病毒的RTLAMP检测方法；2、根据GENBANK（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV）中已登录的烟草环斑病毒的外壳蛋白基因序列D12477，设计F3、B3、FIP（F1CTTTTF2）、BIP（B1CTTTTB2）、LOOP1和LOOP2共6条引物；3、按照建立的烟草环斑病毒的RTLAMP检测方法，设置58、60、63、65四个反应温度进行温度优化试验；4、按照建立的烟草环斑病毒的RTLAMP检测方法，在最佳温度条件

5、下，设置30MIN、60MIN、90MIN三个反应时间进行时间优化试验；5、用烟草环斑病毒、南芥菜花叶病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒、番茄环斑病毒以及马铃薯V病毒等几种常见的植物病毒RNA进行特异性试验；6、用101、102、103、104和105稀释的烟草环斑病毒RNA样品为模板，用常规的RTPCR方法和本研究建立的RTLAMP方法进行扩增灵敏度比对试验；7、用凝胶电泳和荧光染料SYBRGREENI两种方法判断灵敏度试验中的RTLAMP扩增产物，比较荧光染料SYBRGREENI判断实验结果的准确性；8、用已用DASELISA检测呈TRSV阳性的进境大豆样品，采用本研究建立的RTLAMP

6、方法进行扩增检测，结果采用SYBRGREENI染色观察，检验该方法在样品检验中的应用。四、研究的总体安排与进度1、烟草环斑病毒的RTLAMP检测方法的初步建立。2010年12月15日至2010年12月25日。2、RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的引物序列的设计。2010年12月26日至2010年12月31日。3、RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的温度优化试验。2011年1月3日至201年1月9日。4、RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的时间优化试验。2011年1月10日至2011年1月16日。5、本研究设计的引物在植物病毒检验中的特异性检验试验。2011年1月17日至2011年1月23日。6、常

7、规的RTPCR方法和本研究建立的方法检测烟草环斑病毒的灵敏度比较试验；用荧光染料SYBRGREENI判断结果的准确性试验。2011年2月21日至2011年3月6日。7、本研究建立的方法在进境大豆样品检验中的应用试验。2011年3月7日至2011年3月11日。五、主要参考文献1洪健，周雪平ICTV第八次报告的最新植物病毒分类系统J植物病理学报，2005，35（6）192MORIONES,E，NAVASCASTILLO,JTOMATOYELLOWLEAFCURLVIRUS,ANEMERGINGVIRUSCOMPLEXCAUSINGEPIDEMICSWORLDWIDEJVIRUSRESEARCH，2

8、001，711231343BRIDDON,RW，MANSOOR,S，BEDFORD,ID，ETALCLONESOFCOTTONLEAFCURLGEMINIVIRUSINDUCESYMPTOMSATYPICALOFCOTTONLEAFCURLDISEASEJVIRUSGENES，2000，2019264GRACIA,CM，DE,B，GRANVAL,DM，G,VCUESTAOCCURRENCEOFDIFFERENTTOSPOVIRUSESINVEGETABLECROPSINARGENTINAJJOURNALOFPHYTOPATHOLOGY，1998，14742232275JDCASTELLO，AS

9、SISTANTPROFESSOR，ETALDETECTIONOFTOBACCOMOSAICANDTOBACCORINGSPOTVIRUSESINWHITEASHTREESBYENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYJTHEAMERICANPHYTOPATHOLOGICALSOCIETY，1984，6897877906兰玉菲，郗丽君，等植物病毒检测技术J山东农业科学，2006，558627王健华，王运勤，等植物病毒检测技术研究进展J热带农业科学，2005，3（25）71758唐毕锋，马立业，等环介导等温扩增技术的应用和发展J实用医学杂志，2008，22（24）39723974

10、9何琳，徐海圣，等白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立J水产学报，2010，34（4）59860310孙颖杰，岳志芹，等牙鲆弹状病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用J华中农业大学学报，2010，29（2）20320711谢青梅，曹永曹，等H5亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增（RTLAMP）检测技术J中国兽医学报，2010，30（1）414612MANMOHANP，GUILLERMOP，SHINGOINOUE，ETALREALTIMEREVERSETRANSCRIPTIONLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONFORRAPIDDETECTIONOF

11、WESTNILEVIRUSJJCLINMICROBIOL，2004，42125726313POONL，LEUNGCS，CHANKH，ETALDETECTIONOFHUMMANINFLUENZAAVIRUSESBYLOOPMEDIATEDISOTHERNALAMPLICATIONJCLINMCROBIOL，2004，4251956196114黄帆，李琳，等DNA环介导恒温扩增技术速检测结核分枝杆菌的研究J现代食品科技，2008，24（8）83583815包云娟，朱水荣环介导等温技术在假结核耶尔森菌检测中的应用J微生物检测方法，2010，32055956016王敏雅，徐明汉，等沙门菌INVA基因L

12、AMP快速检测法的建立和初步应用J中国卫生检验杂志，2008，18101971198117王中光，张守发，等牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测方法的建立J中国预防兽医学报，2010，32210811118夏永恒，杨兵，等2种鸡免疫抑制性疾病LAMP检测方法的建立J中国动植物检疫，2009，26（5）293219刘宝山，潘树德，等环介导等温扩增技术在畜禽疾病诊断中的应用J中国兽医杂志，2009，459646520赵飞，邹为民LAMP法在水产动物病原快速检测中的应用J南方水产，2007，3（2）717521甘文佳，胡旭初LAMP技术及其在病原诊断中的应用J中国病原生物学杂志，2010，52143145

13、22鲁勇，李红海，等LAMP快速检测沙门菌INVA基因的方法建立于应用J浙江中西医结合杂志，2009，19（4）21621823SFUKUTA，TIIDA，YMIZUKAMI，ETALDETECTIONOFJAPANESEYAMMOSICVIRUSBYRTLAMPJARCHIVESOFVIROLOGY，2003，1481713172024周广青，常惠芸，邵军军环介导等温基因扩增技术及其在病毒检测中的应用J生物技术通讯，2008，229029225刘佳，黄丛林，等环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒J中国农业科学,2010，43（6）1288129426KANEKOH，IIDAAOKIK，ETALSWNSITIVEANDRAPIDDETECTIONOFHERPESSIMPLEXVIRUSANDVARICELLAZOSTERVIRUSDNABYLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONJJCLINMICROBIOL，2005，43332903296