鲨鱼肉酶解液钙螯合物的制备条件优化【毕业设计】.doc

1、本科毕业设计（20_届）鲨鱼肉酶解液钙螯合物的制备条件优化所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月摘要以鲨鱼肉为原料，用中性蛋白酶对其进行水解，以氯化钙为钙离子源螯合修饰得到多肽螯合物，分析螯合时间、温度、PH、水解度、钙离子浓度对螯合反应的影响，通过正交实验确定最优的制备条件为PH80，温度50，时间30MIN，鲨鱼肉酶解度16，钙离子浓度0001MOL/L，得到白色粉末状水不溶物，在最优螯合条件下螯合率8502，并用红外光谱对其进行研究，验证螯合产物的形成。关键词鲨鱼肉；螯合物；钙修饰；工艺优化ABSTRACTUSINGTHESHARKMEATASRAWMATER

2、IAL,HYDROLYSEDBYTHENEUTRALPROTEASE,THENTHEZYMOLYSINGLIQUIDWASCHELATEDWITHCALCIUMCHLORIDE,ANDTHEPOLYPEPTIDECALCIUMCHELATESWEREMADETHEINFLUENCEOFCHELATINGTIME,TEMPERATURE,PH,HYDROLYSISDEGREEANDCALCIUMIONSCONCENTRATIONONTHECHELATINGRATEWEREANALYSED,ANDTHEOPTIMALCONDITIONSOFCHELATINGREACTIONWEREDETERMIN

3、EDBYORTHOGONALEXPERIMENTTHERESULTSSHOWEDTHATTHEOPTIMALCONDITIONSAREASFOLLOWSPH8,TEMPERATUREOF40,TIMEFOR50MINUTES,HYDROLYSISDEGREEOF16,CALCIUMIONCONCENTRATION0001MOL/L,WHITEANDWATERINSOLUBLECHELATESPOWDERWASOBTAINEDANDITSCHELATINGRATEREACHED8502MOREOVER,THECHELATESWASANALYSEDBYIRTOVERIFYTHEFORMATIONO

4、FCHELATINGPRODUCTSKEYWORDSSHARKMEATCHELATESCALCIUMMODIFIEDPROCESSOPTIMIZATION20引言钙元素是人和动物必须的金属元素，是生物体中含量最丰富的矿物质元素，不仅是骨骼和牙齿的主要组成成分，还有许多重要的生理功能，如钙能促进体内一些酶的活动，调节酶的活性作用；参与神经、肌肉的活动和神经递质的释放；调节激素的分泌、参与血液的凝固、细胞粘附、肌肉的收缩活动，钙还具调节心律、降低心血管的通透性、控制炎症和水肿、维持酸碱平衡等作用，是维护机体健康，保证正常生长发育所不可缺少的，因此对生物的生命活动起着极其重要的作用1。我国的膳食结构

5、中植物性食物占多数，其中植酸盐、纤维素、糖醛酸、藻酸钠和草酸等含量较高2，造成食物中的钙吸收利用率并不高，因此积极寻找提高对钙离子吸收的方法有着重要意义。而蛋白质经水解后得到的小肽，则能增加小肠对钙的吸收及其在体内的蓄积，这种由磷酸肽诱导的钙代谢不需要VD的参与1,3。鲨鱼肉质粗糙，但营养丰富，研究表明鲨鱼肉含水7140，总氮含量为379（其中非蛋白氮095），粗脂肪、灰分含量分别为104和084；鲨鱼肉蛋白质的氨基酸比值与人体肌肉成分非常接近，其吸收利用率高，但由于鲨鱼肉中含有较多的尿素，感官上并不令人满意，造成其食用价值不高。目前各地对鲨鱼的捕捞量非常大，但在加工时大部分只利用其中的鱼鳍（

6、只占鲨鱼总重量的15），或用来加工鱼肝油、鱼皮等产品，而其余资源未能得到很好的利用，随之而来的鲨鱼肉便成为廉价的副产品，大部分鱼体组织被当做废弃物丢弃，这样不仅造成蛋白质、脂肪等的浪费，同时造成环境污染。大量研究表明，蛋白质经酶解后会产生具有特殊生理活性的肽类及游离氨基酸，再经过与钙等金属离子进行螯合，不仅能提升其品质与功能性，而且还会体现出新的有益的功能活性，主要体现在以下几个方面生物学价值高。氨基酸螯合物在消化道内的存在状态或吸收方式、组织代谢等方面不同于无机微量元素,在生物体内的金属离子绝大部分是以螯合物的形式存在，微量元素氨基酸螯合物既是机体吸收金属离子的主要形式，又是动物体内合成蛋白

7、质的中间物质4。根据美国科研部门的研究，经氨基酸螯合的微量元素吸收率是无机微量元素的26倍5。比无机盐微量元素有更大、更优越的普遍吸收和消化代谢作用。有良好的生物化学稳定性。有机微量元素中的金属离子在配位体氨基酸的保护下，可有效地抵御与其它离子生成难溶的无盐，更重要的是螯合物的形成克服了无机盐的一些普遍缺点，缓解矿物质之间的颉抗竞争作用。与各种营养物质包括维生素、抗生素具有协同作用6。增强免疫力。有机微量元素可加强动物体酶的激活、生产，促进蛋白质、脂肪和维生素的利用率。实验证明，大多数维生素对铁离子和铜离子的氧化物的催化性都很敏感，如维生素C当有00002MOL/L金属离子存在时，其分解可快1

8、000倍7。有机微量元素具有氨基酸特有的气味适口性好，使动物易于接收。微量元素氨基酸螯合物作为体内生化过程的中间产物，毒副作用小，安全性高，对机体产生副作用小8。双重营养作用和抗菌、抗应激作用。动物在摄入时，同时摄入了动物所必需而饲料中往往缺乏的两种营养物质微量元素、氨基酸，因而具有双重营养作用9。另外，微量元素氨基酸螯合物具有增强抗菌能力，对某些肠炎、皮炎、痢疾和贫血也有治疗作用。在鲨鱼肉的研究方面，国内主要集中在对其产品加工工艺方面的研究，对其深度加工的研究较少。本实验以鲨鱼肉为原料，采用中性蛋白酶为酶源，CACL2为钙源，以钙离子螯合率为指标分析了螯合时间、温度、PH、DH和钙离子浓度对

9、于螯合率的影响，优化出最佳的螯合工艺，并对螯合物进行分析，旨为鲨鱼肉的综合利用提供理论依据。1材料与方法11材料与仪器3111原料新鲜鲨鱼肉由温州某鱼翅加工厂提供，解冻后剔除结缔组织等，切块，绞肉机搅碎。中性蛋白酶（固体粉末）酶活130000U/G，购于无锡市雪梅酶制剂科技有限公司。112仪器设备仪器名称型号生产厂家高速组织捣碎机DS1上海标本模型厂微型旋涡混合仪WH2金坛晓阳电子仪器厂数显恒温水浴锅DKS24上海精宏实验设备有限公司PH值计DOCUPHMETER上海梅特勒托利多仪器有限公司高速冷冻离心机ST16R杭州普天生物技术有限公司旋转蒸发仪RE52D上海青浦卢西仪器厂高速分散器XHFD

10、宁波新芝生物技术科技有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG9076A上海精宏实验设备有限公司电子天平LA114赛多利斯科学仪器北京有限公司分析天平LAC214常熟市百灵天平仪器有限公司消化炉KDN04上海新嘉电子有限公司红外光谱仪TENSOR27德国布鲁克公司113试剂甲醛、氢氧化钠、氯化钙、氨水、硫酸、高锰酸钾、硫酸铜、盐酸、EDTANA2、三氯乙酸、铬黑T、乙醇，邻苯二甲酸氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、溴化钾，均为分析纯。12实验方法121酶解液的制备鲨鱼肉绞碎称量加水调PH酶解灭酶冷却至室温离心取上清液酶解液122酶解液钙螯合物的合成工艺酶解液测水解度按比例加入CACL2搅拌调PH震荡合成加入

11、无水乙醇分级沉淀离心真空浓缩冷冻干燥蛋白酶解液钙螯合物。123水解度（DH的计算蛋白质的水解度代表蛋白质在水解过程中，肽键被裂解的程度和百分比，在水解过程肽键断裂后，就会有一个新的COOH和NH2形成，因此，水解肽键的数目就可以根据水解后测定新形成的末端COOH或NH2基团的量确定10，溶液中游离氨基酸的含量会随着水解的进行而增加，因此游离氨基酸的含量可以表征蛋白质水解的程度。水解度的计算DH（已水解的肽键数/原料中的总肽键数）100（BC/AC100公式中A原料中总氨基氮数；B水解液氨基氮数；C原料游离的氨基氮数。B和C通过游离氨基酸的测定方法测定，C也由上述氨基酸测定方法测定完成，用10M

12、L非酶解样品（先经灭酶处理）代替。124游离钙含量的测定采用EDTA滴定法。采用过量乙醇提取反应体系中未螯合的钙离子，过量乙醇能够使螯合后的多肽化合物沉淀，但不影响溶液中游离的钙离子。取螯合后的溶液10ML，加入10ML的PH10的氨缓冲溶液，用410MMOL/L的EDTA钠盐溶液滴定。以铬黑T做指示剂，反应体系颜色由紫色变为亮蓝色，平行3次并做空白组。铬黑T常用作测定MG2、ZN2、PB2、MN2、CD2、HG2等离子的指示剂，与二价金属离子形成的络合物都是红色或紫红色的。在PH10的条件下会与游离的钙离子结合形成紫色化合物，因此，只有在PH711范围内使用，指示剂才有明显的颜色变化。根据实

13、验，最适宜的酸度为PH是9105。铬黑T试剂的配置05G的铬黑T和45G的盐酸羟铵用乙醇定容到100ML。PH10氨缓冲溶液的配置称取氯化铵27G与浓氨水175ML混合并定容至500ML。125螯合率的计算螯合率（）（钙离子总含量游离钙离子含量）/钙离子总含量100游离钙离子含量由滴定消耗EDTA溶液求出。13酶解液钙螯合物的单因素和正交试验分别试验水解度、时间、温度和PH单因素对螯合率的影响，在此基础上确定正交试验的因素及水平范围，选用L934正交表进行实验，通过正交实验确定最优的螯合条件。14红外光谱测定方法傅里叶红外光谱分析，采用KBR压片法，4000400/CM区间扫描红外吸收。螯合产

14、物经酒精分级沉淀后得到的螯合产物，冻干后称取2MG样品，加入干燥过的光谱纯KBR200G，研磨均匀，取适量用压片机压成透明薄片，装入压片模具，抽气加压，压力约为60MPA，维持35MIN，放入红外光谱仪中检测，得到红外光谱图。15数据处理实验平行次数35次，取平均值进行计算。2结果与分析21蛋白酶种类的确定以水解度11为指标，对风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶种类进行筛选（风味蛋白酶酶解PH为75，中性蛋白酶酶解PH为7，碱性蛋白酶酶解PH为8，酶解温度40，酶量2000U/G鲨鱼肉），结果见图1。图1不同酶对鲨鱼肉DH的影响由图1可知，碱性蛋白酶的酶解效果最差，风味蛋白酶与中性蛋白酶的酶解

15、效果较接近。考虑到中性蛋白酶的酶解条件更为温和，所以本实验决定使用中性蛋白酶作为实验用酶。由之前的研究得到优化后的酶解条件固液比为19，酶解温度40，酶用量为3000U/G。22反应时间对螯合率的影响024681012141618005115225335445酶解时间（H）水解度（）风味蛋白酶中性蛋白酶碱性蛋白酶5在固液比为19，酶解温度40，酶用量为3000U/G，酶解25H得到鲨鱼肉酶解物。在室温20，自然PH，螯合时间（1080MIN），研究螯合时间对螯合率的影响，结果见图2。图2螯合时间对螯合率的影响由图2可以看出，随着螯合反应时间的延长，螯合率增加，但整个螯合过程在30MIN内已基本

16、完成，螯合率达80左右，故确定螯合时间为30MIN。研究表明蛋白肽与金属元素的螯合反应速度均较快，一般40MIN内可以反应完全。例邱东玲等12对于丝素肽与锌螯合的最佳时间为30MIN，付文雯等13关于牛骨蛋白酶解制备胶原多肽螯合钙的最佳时间为40MIN，赵洪雷等14对于鲢鱼蛋白小肽螯合的最佳时间为20MIN。23钙离子浓度对螯合率的影响在自然PH，室温，反应时间30MIN下，配置使溶液中钙离子浓度分别为00005、000750001、00125、0015MOL/L,即在100ML的酶解液中分别滴入05ML、075ML、100ML、125ML、15ML，1MOL/L的氯化钙，结果见图3。图3钙离

17、子浓度对螯合率的影响由图3得到，在浓度00005到00010MOL/L，螯合率较高，说明此时多肽过量，之后随着钙离子浓度的增加，螯合率开始出现下降，说明钙离子浓度过量，综合考虑取钙离子浓度为0001MOL/L为宜。24螯合温度对螯合率的影响在固液比为19，酶解温度40，酶用量为3000U/G，酶解25H得到鲨鱼肉酶解物。在自然PH，螯合30MIN，研究螯合温度（1060）对螯合率的影响，结果见图4。707274767880820102030405060708090时间（MIN）螯合率（）010203040506070809000002500005000007500010000012500015

18、0000175钙离子浓度（MOL/L）螯合率（）6图4螯合温度对鲨鱼肉酶解液钙螯合率的影响研究表明多肽与金属元素的螯合在室温下反应即可15。由图4可知，温度对于鲨鱼肉酶解液的钙螯合过程有一定的影响，低温时螯合率会随着温度的升高而提升，之后随着温度的升高螯合率反而降低。本实验条件下鲨鱼肉酶解液的钙螯合温度在50时较合适，螯合率达到最大8207。实验中发现在不同温度下螯合产生的沉淀物的性状并不相同，随着温度的升高，絮状沉淀会变得更加明显，推测可能是因为高的温度会使多肽螯合物聚集。25PH对螯合率的影响PH是影响多肽螯合钙离子形成螯合物的最重要因素。在固液比为19，酶解温度40，酶用量为3000U/

19、G，酶解25H得到鲨鱼肉酶解物。在50下螯合30MIN，研究PH（59）对螯合率的影响，结果见图5。图5PH对螯合率的影响可以看出在PH在58范围内，螯合率随PH的增大而增大，原因在于NH2和COOH配位能力增强16。但PH8的时候，螯合率达到最大8135，其后随着PH的继续增大螯合率有所下降，在PH值较低的酸性条件下，反应体系中存在较多氢离子，而氢离子可竞争性与供电子集团结合，从而取代金属离子，导致螯合率下降17。如果反应体系PH值过高，溶液中过多的氢氧根离子易与钙离子生成CA（OH2，PH值为80时螯合率最高说明了此时反应体系中水解液多肽受氢离子和氢氧根离子的影响最小，最有利于钙离子与多5

20、0556065707580859001020304050607080温度（）螯合率（）0102030405060708090445555665775885995PH螯合率（）7肽形成螯合物，因此，选择80作为螯合的最适PH。林萍等18以氯化亚铁和甘氨酸为原料制备了甘氨酸螯合铁，其反应PH值为55时螯合率最高，姚磊等19以甘氨酸和硫酸亚铁为原料制备甘氨酸亚铁螯合物的最适PH值为40，秦卫东等20以脱脂豆粨酶酶解复合氨基酸为原料制备复合氨基酸亚铁时选择最适PH80，夏松养等21以低值鱼蛋白制备蛋白酶水解液钙螯合物的最适PH为7，通过比较先前的研究可以发现，林萍和姚磊等所制备的亚铁螯合物所选用的原料

21、为单体氨基酸，而秦卫东及夏松养等所选用的原料为蛋白水解产物。从螯合物的制备原料看，甘氨酸属于单体氨基酸，其最适螯合PH在酸性范围内；而蛋白水解液由于游离氨基酸相对较少，螯合体多以多肽形式存在，其最适合PH值位于中性到碱性范围22。26水解度对螯合率的影响在固液比为19，酶解温度40，酶用量为3000U/G，酶解不同时间得到不同DH的鲨鱼肉酶解物。在PH80，反应温度为50，螯合时间30MIN，100ML水解液中分别加入1MLCACL2（1MOL/L）溶液，比较不同水解度对钙离子螯合率的影响，结果如图6。图6鲨鱼肉酶解液水解度对螯合率的影响水解度对于螯合率有着重要的影响，图6中，水解度低于12时

22、，螯合率随着水解度的增加而增大，水解度在1220间趋于稳定，并达到最大值，螯合率为8111，但水解度高于20时又随着水解度的加大而下降，因为水解度的高低影响着适合螯合的肽段与螯合金属离子的摩尔比，鲨鱼肉酶解液在适当的水解度下能够拥有足够数量的适合螯合的小肽，配体摩尔比是影响金属离子与多肽螯合反应的一个重要因素，如果配位比太小，生成的螯合物不稳定；反之，若配位比太高，会造成多肽利用率降低22，23。本实验中水解度处在1220的条件下，拥有适合螯合的肽段最多，在低水解度下，酶解出的肽段太大，不能满足螯合的需求，但当水解度更高时，螯合率的下降可能是因为适合螯合的肽段被分解，因此与金属离子的结合能力降

23、低，导致螯合率的下降。本实验中水解度越大，对应的时间也越长，因此选择12的水解度。27最佳螯合条件的确定为了优化螯合工艺条件，在以上单因素实验基础上采用螯合温度4060、PH7585水解度1220，做三因素三水平的正交实验，以确定最佳工艺条件，选用因素及水平表如表1，结果及极差、方差分析见表2。0102030405060708090481216202428水解度螯合率（）8表1因素水平表TABLE1FACTORSANDLEVELS因素水平A温度，CBPHC（DH，）140751225080163608520表2正交试验结果从正交实验的分析得知，PH对实验结果影响显著（F比值大于1）,水解度与温

24、度对实验结果的影响并不显著（F比值小于1）,以上三个因素对螯合率的影响顺序为BCA,与他人所述文献中相符，最佳实验条件为A2B2C2,因此，鲨鱼肉酶解液钙螯合物的最佳螯合条件为钙离子浓度0001MOL/L，PH值为80，反应温度为50，反应时间为30MIN，水解度为16，此时测得螯合率为8502。28螯合产物的红外分析图710分别代表鲨鱼肉酶解粉与钙离子螯合的产物的红外光谱图。其中图8为螯合反应后不溶于水试验号A空白BC螯合率（）111117749212218025313337921421238156522317849623218059731327930832137844933217997K1

25、7898793578847865K28111790680498005K37924799279007964极差R113086165140偏差平方和211049993092自由度222F比0621146909109的物质，图9表示螯合反应后上清液加入等体积50酒精分级沉淀得到的物质，图10是上清液加入80的酒精分级沉淀得到的物质。F陆焰酶解粉20酶解液粉状物28/03/20113389002964961651191454631399991244701078921035845965153266500100015002000250030003500WAVENUMBERCM140455055606570

26、TRANSMITTANCEPAGE1/1图7鲨鱼肉酶解粉的红外光谱分析F陆焰水不溶10酶解液粉状物28/03/20113387002962662925442854251652861433471234111049008769756230500100015002000250030003500WAVENUMBERCM13035404550556065TRANSMITTANCEPAGE1/1图8水不溶性螯合物的红外光谱分析F陆焰50不容20酶解液粉状物28/03/2011341867293533164821141457123439104282553715001000150020002500300035

27、00WAVENUMBERCM14045505560657075TRANSMITTANCEPAGE1/1图950酒精不溶性物螯合物的红外光谱分析10F陆焰80不容10酶解液粉状物28/03/20113396182969271656581557641402091316501239001080241046318790760832500100015002000250030003500WAVENUMBERCM13040506070TRANSMITTANCEPAGE1/1图1080酒精不溶性螯合物的光谱分析分析图7、8、9、10，可以看出，酶解粉与其螯合物的吸收峰相比，在强弱和位置上有明显的变化，在338

28、517CM1、103546CM1处酶解液OH的伸缩振动峰在形成螯合物以后向高波数移动，并且变弱，165260CM1处是COOH的CO伸缩振动峰，在形成螯合物后明显变弱，红外的这种位移和变弱说明钙离子与酶解液中的OH发生了螯合作用。后面三个样品在31303030CM1胺峰消失，而在110CM1左右出现了PTNH2吸收峰，证明钙离子与COO有较强结合。3小结鲨鱼肉酶解液合成的最优条件物料比为钙离子浓度0001MOL/L，PH为80，反应温度为50，反应时间为50MIN，水解度16，在此条件下螯合率可达8502，其中影响较大的是PH，水解度，因此，样品制备中要严格控制。由红外光谱分析螯合产品螯合前后

29、有明显的变化，证实有螯合产物的形成，得到的螯合产物经乙醇分级沉淀后可得到3种产物，为后面研究分级沉淀后不同产物的抗菌性，抗氧化性做准备。本实验为鲨鱼肉酶解液螯合产物的进一步研究奠定了基础，为鲨鱼肉利用，螯合制品的开发开辟了新的路径。参考文献1刘瑞生微量元素氨基酸螯合物的应用J中国牧业通讯,2007,1670712甘林火,翁连进,邓爱华制备氨基酸螯合钙的研究进展J氨基酸和生物资源,2008,30144463HUTSCHENREITERS,NEUMANNL,RDLERU,ETALMETALCHELATINGAMINOACIDSASBUILDINGBLOCKSFORSYNTHETICRECEPTOR

30、SSENSINGMETALIONSANDHISTIDINETAGGEDPROTEINSJCHEMBIOCHEM2003,4,134013444吴信,印遇龙,邢芳芳等国内外微量元素氨基酸螯合物的应用研究进展J猪业科学,2008,350367705崔志英,舒绪刚,李大光微量元素氨基酸螯合物应用现状和发展J广东饲料,2008,170129316SCARPH,DEWAEFFECTIVENESSOFTREATMENTOFIRONDEFICIENCYANEMIAININFANTSANDYOUNGCHILDRENWITHFERROUSBISGLYCINATECHELATEJNUTRITION2001,175

31、3813847张维睿,杨桂芹,龙雷微量元素氨基酸螯合物的营养功能及其在动物生产中的应用J河南畜牧兽医,2006,2705898姚宝强,刘丽氨基酸微量元素螯合物的研究与应用J兽药与饲料添加剂,2008,13319229程曙光,陈佳,程茂基微量元素氨基酸螯合物在猪生产上的应用研究进展J养殖与饲料,20067252710徐英操,刘春红蛋白质水解度测定方法综述J食品研究与开发，2007071731751111霍健聪带鱼下脚料蛋白酶水解物亚铁螯合修饰及其抑菌机理研究D2009,01497012邱东玲,胡长丽,崔建云丝素肽与锌螯合工艺条件的研究J食品研究与开发2008,2907384213付文雯,马美湖,

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