NJ632中腺苷酰化结构域的基因重组表达与纯化【开题报告】.doc

1、毕业论文开题报告生物工程NJ632中腺苷酰化结构域的基因重组表达与纯化一、选题的背景与意义许多微生物能利用非核糖体肽合成酶NRPSS合成结构复杂、种类繁多的的生物活性肽。虽然科学家们认识这个酶系已有几十年了,但直到最近才了解NRPSS的工作原理,并且开始尝试改变酶的结构,利用生物工程技术合成更多种类的药物。非核糖体肽因其独特的理化特性和药理学特性已被广泛关注,极具商业开发潜力。本研究小组从海绵体表筛选获得一株具有较强抗菌和细胞毒活性的菌株NJ632，通过生物信息学方法成功寻找到NRPS编码基因并克隆成功。鉴于NRP类化合物具有抑菌广谱性等特点，编码该类物质的NRPS值得深入研究。我们对NRPS

2、中的多个结构域模块进行体外克隆及蛋白纯化，尤其是对其中的A3结构域做了大量研究工作，包括蛋白表达，结构测定等。该课题初步探索了NRP类化合物合成的分子机制，为后期彻底揭示NRP类化合物的合成原理奠定坚实的理论基础，为今后的药物开发与工业化生产有着积极而重要的意义。同时，从实验角度来印证NRPS的结构及功能特异性是否与利用生物信息学技术预测结果一样，弥补了后者预测存在的不稳定性及准确性，从而在一定程度上促进生物信息学的发展。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容将从海绵中筛选到的附生微生物NJ632中的可能参与活性产物合成的NRPS基因簇中的A结构域导入异源宿主中，利用异源宿主本身自带的或

3、人工修饰的表达调控元件使该结构域得到有效的表达。同时，利用改造的表达质粒所携带的HIS标签对异源表达的A结构域进行体外表达与纯化，为后续的酶活实验提供良好的蛋白样品。拟解决的主要问题1异源表达条件的优化2目的蛋白的分离和纯化三、研究的方法与技术路线方法利用分子生物学中分子克隆的常规方法制备用于表达NJ632的NRPS基因簇中A结构域的表达系统。采用已商品化的PET28A和PQE60表达系统分别构建了含有NRPS基因簇的A结构域的重组表达质粒PZPA32，PZPA33。同时利用表达载体特定的表达宿主对A结构域进行正确、高效表达并纯化蛋白。技术路线如下目的基因的获得基因载体的选择和构建目的基因和载

4、体的连接重组DNA分子导入表达宿主细胞重组体筛选克隆基因表达蛋白的检测与纯化四、研究的总体安排与进度20101112选题，进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书20101220111实验阶段，对基因的表达和纯化进行记录与分析2011420115完成外文翻译，论文撰写，提交并答辩五、主要参考文献1CROSAJH,WALSHCTGENETICSANDASSEMBLYLINEENZYMOLOGYOFSIDEROPHOREBIOSYNTHESISINBACTERIAJMICROBIOLMOLBIOLREV,2002,662232492WELKERM,DOHRENHCYANOBACTERIALPE

5、PTIDESNATURESOWNCOMBINATORIALBIOSYNTHESISJFEMSMICROBIOLREV,2006,305305633MIAOV,COEFFETLEGALMF,BRIANP,ETALDAPTOMYCINBIOSYNTHESISINSTREPTOMYCESROSEOSPORUSCLONINGANDANALYSISOFTHEGENECLUSTERANDREVISIONOFPEPTIDESTEREOCHEMISTRYJMICROBIOLRES,2005,151150715234SCHWECKET,GOTTLINGK,DUREKP,ETALNONRIBOSOMALPEPTI

6、DESYNTHESISINSCHIZOSACCHAROMYCESPOMBEANDTHEARCHITECTURESOFFERRICHROMETYPESIDEROPHORESYNTHETASESINFUNGIJCHEMBIOCHEM,2006,76126225RICHARDTA,KEMMET,WAGNERS,ETALEBONY,ANOVELNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEFORBETAALANINECONJUGATIONWITHBIOGENICAMINESINDROSOPHILAJJBIOLCHEM,2003,27841160411666KASAHARAT,KATOTNU

7、TRITIONALBIOCHEMISTRYANEWREDOXCOFACTORVITAMINFORMAMMALSJNATURE,2003,4228328397GEWOLBJWORKINGOUTSIDETHEPROTEINSYNTHESISRULESJSCIENCE,2002,295220522078GRUNEWALDJ,MARAHIELMACHEMOENZYMATICANDTEMPLATEDIRECTEDSYNTHESISOFBIOACTIVEMACROCYCLICPEPTIDESJMICROBIOLMOLBIOREV,2006,701211469SHARMAA,JOHRIBNGROWTHPRO

8、MOTINGINFLUENCEOFSIDEROPHOREPRODUCINGPSEUDOMONASSTRAINSGRP3AANDPRS9INMAIZEZEMAYSLUNDERIRONLIMITINGCONDITIONSJMICROBIOLRES,2003,15824324810CRAMERRAJR,GAMCSIKMP,BROOKINGRM,ETALDISRUPTIONOFNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEINASPERGILLUSFUMIGATUSELIMINATEGLIOTOXINPRODUCTIONJEC,2006,597280311PICOSIS,VALLADARE

9、SA,FLORESE,ETALNITROGENREULATEDGENESFORTHEMETABOLISMOFCYANOPHYCIN,ABACTERIALNITROGENRESERVEPOLYMERJJBIOCHEM,2004,279115821159212LIUJ,FARMERJD,LANEJWS,ETALCALCINEURINISACOMMONTARGEOFCYCLOPHILINCYCLOSPORINAANDFKBPFK506COMPLEXESJCELL,1991,6680781513SAMELSA,WAGNERB,MARAHIELMA,ETALTHETHIOESTERASEDOMAINOF

10、THEFENGYCINBIOSYNTHESISCLUSTERASTRUCTURALBASEFORTHEMACROCYCLIZATIONOFANONRIBOSOMALLIPOPEPTIDEJJMOLBIOL,2006,35987688914SIEBERSA,MARAHIELMALEARNINGFROMNATURESDRUGFACTORIESNONRIBOSOMALSYNTHESISOFMACROCYCLICPEPTIDESJJBACTERIOL,2003,1857036704315ROONGSAWANGN,LIMSP,WASHIOK,ETALPHYLOGENETICANALYSISOFCONDE

11、NSATIONDOMAINSINTHENONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASESJFEMSMICROBIOLLETT,2005,25214315116SCHWARZERD,FINKINGRANDMARAHIELMANONRIBOSOMALPEPTIDESFROMGENESTOPRODUCTSJPRODREP,2003,2027528717BALDWINTOFIREFLYLUCIFERASETHESTRUCTUREISKNOWN,BUTTHEMYSTERYREMAINSJSTRUCTURE,1996,422323718LEESG,LIPMANNFTYROCIDINESYNTHE

12、TASESYSTEMJMETHODSENZYMOL,1975,4358559019STCAHELHAUST,MOOTZHD,MARAHIELMATHESPECIFICITYCONFERRINGCODEOFADENYLATIONDOMAININNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASESJCHEMBIOL,1999,649350120CHALLISGL,RAVELJ,TOWNSENDCAPREDICTIVE,STRUCTUREBASEDMODELOFAMINOACIDRECOGNITIONBYNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEADENYLATIONDOMA

13、INSJCHEMBIOL,1999,721121821ACKERLEYDF,CARADOCDAVIESTT,LAMONTILSUBSTRATESPECIFICITYOFTHENONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEPVDDFROMPSEUDOMONASAERUGINOSAJJBACTERIL,2003,1852848285422STACHELHAUST,MOOTZHD,BERGENDAHLV,ETALPEPTIDBONDFORMATIONINNONRIBOSOMALPEPTIDEBIOSYNTHESIJJBIOLCHEM,1998,2732277323HENNINGDM,MOHAMEDAMBIOSYNTHETICSYSTEMSFORNONRIBOSOMALPEPTIDEJCURROPINCHEMBIOL,1997,154355124BECKERJE,MOORER,MOOREBSCLONING,SEQUENCING,ANDBIOCHEMICALCHARACTERIZATIONOFTHENOSTOCYCLOPEPTIDEBIOSYNTHETGENECLUSTERMOLECULARBASISFORIMINEMACROCYCLIZATIONJGENE,2004,3253542