1、毕业论文开题报告生物工程组胺产生菌的筛选及鉴定一、选题的背景与意义组胺(HISTAMINE)为一种生物胺,可在许多动、植物中发现。由于它是由微生物作用于其前体组胺酸而产生的,普遍认为食物中存在着组胺1。比如水产品中最具毒性的生物胺是组胺,组胺通过与细胞膜上的两类受体(H1和H2)作用而发挥毒性。在鱼体中游离组氨酸在组胺酸脱羧酶催化下,发生脱羧反应形成组胺。当机体摄入组胺超过100MG时,即可引起过敏性食物中毒2。鲭科鱼类体内含有较多游离的组氨酸,含量随鱼种类的不同而变化。如金枪鱼约为15G/KG,而鲱鱼则仅为1G/KG。组胺是海洋鲭科鱼类中含量最多和最主要的生物胺,因此组胺含量常被作为检测这类
2、水产品腐烂变质程度的指标。组胺属于单胺类神经递质,参与多种生理病理活动过程,如对睡眠、摄食、体温、精神情感性疾病的调节3。组胺本身又有强大和广泛的药理作用,主要影响血管、平滑肌和腺体的功能4。对血管的作用组胺可使小动脉、毛细血管和小静脉扩张,使循环血量相对减少,以及毛细血管通透性增加对平滑肌的作用组胺使支气管平滑肌痉挛,引起呼吸困难。对胃液分泌作用组胺对胃液分泌具有高度选择性,在尚不致使血压下降的小剂量时即能显著促进其分泌。组胺是型变态反应变态反应性疾病发病率约占全球人口的3040,其对人类的危害极大中最重要的炎性介质,深入研究组胺,对食物过敏的防治具有重要的意义5。组胺生成菌普遍存在于海水环
3、境中,也生活在活鱼的鳃和内脏中6。当鱼体存活时,该细菌不对鱼产生危害。一旦鱼死亡,鱼的防御系统就破坏,在适宜温度下,组胺菌就迅速生长并产生组胺。市售鱼类存在组胺安全隐患,在加工调理时温度控制不当,食用时就会引起组胺的中毒现象发生。然而,虽有相关的卫生标准,但近年来鱼体中组胺含量超标而引起的中毒事件屡有发生7,8。主要原因是有些人对鱼类及海产品的可食性与组胺含量有关缺乏了解,不清楚组胺含量是评价鱼类及海产品腐败程度的重要指标。随着经济的繁荣、食品安全问题越来越受社会的关注,人们不仅仅局限于吃饱,还要考虑吃的安全和营养,因此,通过对组胺进行研究和认识可以提高和改善食品的质量及安全性。并且组胺原本就
4、具有药理和毒理学作用,因此通过对组胺的研究可以更好的驾驭这种化学活性物质,使其弊端减为最小,使其益处为人所用,充分利用这种活性物质。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1组胺产生菌的筛选。配制筛选产组胺的培养基,从鱼体中进行产组胺菌的分离筛选。2组胺产生菌的鉴定。进行产组胺菌的生理生化鉴定,及PCR鉴定。三、研究的方法与技术路线研究方法1总菌数与各类菌的测定157天步骤1稀释11倒平板将VRBG琼脂培养基、PI琼脂培养基、TCBS琼脂培养基以及组氨菌选择培养基加热溶解,冷却至5560时,分别到平板。12称取25G样品放入盛有225ML稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1MIN2MIN,制
5、成110的样品匀液。131ML无菌吸管或微量移液器吸取110样品匀液1ML,沿管壁缓慢注于盛有9ML稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1100的样品匀液。14按13操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1ML无菌吸管或吸头。15根据对样品污染状况的估计,选择2个3个适宜稀释度的样品匀液,在进行10倍递增稀释时,吸取适量的匀液涂布到各平板中。每个稀释度做两个样,同时,分别吸取适量的空白稀释液涂布到各平板中作为空白组。检样25G样品225ML01W/VSTERILEPEPTONEWATER,匀质10
6、倍系列稀释涂布选择23个合适的稀释度的样品匀液,取适量的样液涂布到不同的平板中,两个平行各平板计数,报告2培养各平板置于151的恒温箱中培养7天(24,24H)3菌落计数参考国标4结果报告参考国标2组胺菌的二步筛选法3524H3524H检样25G样品225ML01W/VSTERILEPEPTONEWATER,匀质10倍系列稀释涂布选择23个合适的稀释度的样品匀液,吸取适量的样液涂布到倒好的平板中,依据菌落特性随机选取一些菌落,纯化,后4下保存于TSA斜面中,待用挑取TSA斜面中的菌株接种到组胺菌选择培养基平板中培养观察菌落特性,是否出现有紫色光晕的紫色菌落,有则为阳性将所有阳性菌落接种到组胺酸
7、肉汤培养基,测产组胺活性报告结果实验步骤1稀释11倒平板将VRBG琼脂培养基、PI琼脂培养基、TCBS琼脂培养基以及组氨菌选择培养基加热溶解,冷却至5560时,分别到平板。12称取25G样品放入盛有225ML稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1MIN2MIN,制成110的样品匀液。131ML无菌吸管或微量移液器吸取110样品匀液1ML,沿管壁缓慢注于盛有9ML稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1100的样品匀液。14按13操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1ML无菌吸管或吸头。15根据
8、对样品污染状况的估计,选择2个3个适宜稀释度的样品匀液,在进行10倍递增稀释时,吸取适量的匀液涂布到各平板中。每个稀释度做两个样,同时,分别吸取适量的空白稀释液涂布到各平板中作为空白组。2培养各平板置于351的恒温箱中培养24H3纯化观察菌落特性,并记录,同时依据其特性,随机选择一些菌落,挑取接种到新的培养基平板中,置于351的恒温箱中培养24H,进行进一步的分离纯化(多次划平板)。使菌落成为带菌落。将培养后长出的带个菌落分别挑取少许细胞接种到TSA斜面,置于4条件下保存,培养24H。4二次筛选将TSA斜面上的菌种接种到组胺菌选择培养基中,在35下培养24H。观测菌落特性,是否出现带有紫色光晕
9、的紫色菌落出现,有则为阳性。5产组胺活性测定挑取一环各呈阳性的单菌落分别接种到9ML组氨酸肉汤培养基中,置于351的恒温箱中培养20H去1ML培养液转移到新的盛有9ML组氨酸肉汤培养基试管中,置于351的恒温箱中培养18H后培养液在13000RPM下离心15MIN上清液用于组胺含量分析。6菌株的鉴定技术路线组胺产生菌的筛选组胺产生菌的生理生化鉴定PCR鉴定四、研究的总体安排与进度201010201101查询与论文有关的资料、撰写试验计划、熟悉基本的实验操作。201103初201104中旬产组胺菌的分离、筛选、鉴定。201104中旬201104下旬整理数据,撰写论文。201105完成毕业答辩五、
10、主要参考文献1金安宝水产品中组胺测定方法的改进中国卫生检验杂质J,2007,1711491502谢超,王阳光,邓尚贵,等水产品中组胺控制降解技术研究概论J食品工业科技,2009,30124144163李伟荣,黄天来,王宁生,等高效液相色谱/电化学检测法测定大鼠下丘脑的组胺和5_羟色胺J分析测试学报,2004,23636394司红彬组胺与抗组胺药J兽医导刊,2009,144833355蒋红玲,向军俭食物过敏中肥大细胞释放组胺的研究进展J医学理论与实践,2007,20(3)2692716陶志华,佐藤实海水中组胺菌的分离及其理化性质分析J生物技术,2009,19142447徐金德一起秋刀鱼引起组胺食物中毒事件的调查J海峡预防医学杂志,2004,105418曾艳,周朝虹58例扁舵鲣鱼所致组胺中毒的急救J中国热带医学,2009,04704705
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