男性学实验室检查与质控.ppt

1、王振强zhen-qiang wang,男性学实验室检查与质控,山西省儿童医院 妇幼保健院 生殖中心 男性学实验室,不育症的发生率为1015，其中约30由于男性因素引起的，统称为男性不育症。男性不育症患者大部分没有明显的临床症状。实验室检测是评价男性生殖能力的重要手段。,量 2.0ml或更多PH 7.2或更多精子密度 20106ml或更多总精子数 40106/一次射精或更多活力 射精后60分钟内，50或更多具有前向运动 （即a+b级），或25或更多具有快速前向运动（a级）畸形率 85存活率 50或更多存活白细胞 1106ml 该指标参考WHO人类精液及精子宫颈粘液相互作用实验室检验手册（第四版）

2、,精液分析正常参考值：,正常精子状态 射出的精液符合参考值少精子症 精子浓度低于参考值 (精子密度20106ml或总精子数40106/一次射精)弱精子症 精子活力低于参考值(a+b级50或a级25)畸精子症 具有正常形态的精子少于参考值(正常形态2天避免性生活,性交后912小时进行试验.3. 在阴道后穹窿部吸取混合样本及用另一个注射器或导管吸取宫颈管内的粘液标本。将这些标本置于载玻片上，加盖玻片，显微镜观察结果观察 性交后912小时进行精子活力分级:a，快速直线前向运动；b，慢或缓慢的前向运动； C，非前向运动；d，不活动精子。意义:能够提供精子寿命和存活情况.前向运动的精子可排除宫颈因素作为

3、不育原因的可能性。,简化的玻片试验将一滴宫颈粘液置于载玻片上，用盖玻片铺平。载玻片两侧各滴1滴精液，使其与盖玻片边缘接触，借助于毛细作用使精液移向盖玻片下，在宫颈粘液与精液之间形成一个清晰的接触界面。该载玻片置于湿润的温箱内，37孵育30分钟结果报告正常精子穿透粘液90%以上具有直线运动的精子精子穿透粘液相的距离40106/ml时，用F-10培养液按比例稀释精液，以避免精子碰撞造成分析错误。取一滴精液置Hamilton CASA系统进行分析。系统设置：CASA系统温度设置为37，根据精子密度选择Analysis setup: Standard、High density、user-1（低密度精子

4、分析）。应选择精子分布均匀的视野扫描，如精子密度20106/ml时，应分析超过400条精子。显微镜检查未见精子的标本应用3000g离心15分钟，把所有沉渣重新悬浮成0.2ml，再彻底检查后发现无精子，才能作出无精子的判断。如离心后发现有精子可按下列公式计算精子密度。离心后体积精子密度 精液总量 精子密度（106/ml） 8 精子存活率计数将新鲜精液与伊红染液1：1在试管中混匀，30秒后取一滴上述液体置载玻片上并覆以盖玻片在400倍光学显微镜下观察。活精子不着色，死精子被染成红色，观察200个精子计数存活率。,男性学组合项目计算机辅助精子分析（CASA）VCL-曲线速度（m/s）精子头沿其实际的

5、曲线。VSL-直线速度（m/s）根据精子头在开始检测时的位置与最后所处位置之间的直线运动的时间平均速度。VAP-平均路径速度（m/s）精子头沿其空间平均轨迹移动的时间平均速度。ALH精子头侧摆幅度（m/s）精子头沿其空间平均轨迹侧摆的幅度。LIH-直线性。曲线轨迹的直线性。VSL/VCL.WOB-摆动性。精子头沿其实际轨迹的空间平均路径摆动的尺度。VAP/VCL.STR-前向性。空间平均路径的直线性。VSL/VAP.BCF-鞭打频率（鞭打次数、秒）。精子曲线轨迹越过其平均路径轨迹的时间平均速度。MAD-平均移动角度（度）精子头沿其曲线轨迹瞬间转折角度的时间平均绝对值。,男性学组合项目9 精子形

6、态评估：涂片取一小滴精液（5 20 ul）于载玻片上，以另一推片把精液推成薄片，干燥。如果精子密度超过20106 / ml, 取5l，精子密度 1.6与未治疗不育夫妇的低生育率有关，精子畸形指数SDI 1.6提示体外受精失败的阈值。,精子顶体酶测定 顶体酶存在于精子顶体内膜及赤道部膜上， 是受精过程中重要的蛋白水解酶. 当精子头部进入卵透明带，顶体酶原被活化为顶体酶水解卵透明带，使精子穿过卵透明带最终与卵子融合。 顶体酶活性反映精子质量，顶体酶活力不足可能导致不育。临床精子成活率低、死精子症以及严重生殖系统感染，特别是溶脲支原体严重感染时可造成精子顶体酶活性降低。 顶体酶活性是判断男性精子功能

7、和生育力强弱的重要评价指标。,男性学组合项目,男性学组合项目,免疫性不育检测指标:精子膜表面抗体混合凝集反应（MAR） 检测的是不需要任何处理的精子和免疫珠试验（IBT）检测的是经洗涤后的精子 阳性 10%活动精子包裹在致敏微球上 MAR是WHO推荐的免疫性不育诊断方法 作为精子膜表面抗体常规筛选方法,前列腺分泌功能指标精浆锌：与精子活力、抗氧化及前列腺分泌功能有关精浆柠檬酸：与前列腺分泌功能，精液液化有关精浆酸性磷酸酶:与前列腺炎有关精子顶体酶活性定量检测判断男性精子功能和生育力强弱的重要评价指标，顶体酶活性降低精子将难以穿透卵细胞从而导致不育。核蛋白组型转换蛋白组型转换缺陷或异常可引起男性

8、不育或胚胎早期夭折流产。,男性学组合项目二,精子体外处理方法：洗涤法 上游法密度梯度离心法,洗涤法 目的：增加活动精子密度和洗去精浆中影响精子活力的物质，如白细胞、细菌、抗精子抗体等。方法：选用Hams F10、HTF、Earles等上述任何一种培养液，加10血清及抗生素。液化精液移于15ml锥形离心管内，加3倍剂量的培养液。离心500g8，弃上清夜，同法重复洗涤一次。留沉淀加入0.5ml培养液，制成精子悬液，密度调整为40106/ml,上游法目的： 利用活动精子具有主动游过液体界面进入不同培养液的能力，而达到自行与死精，凝集精子，畸形精子和细胞杂质分离。 适用于正常精液液化不良精液。方法：液

9、化精液1：3加入培养液，离心200g8，洗涤2次。留沉淀加入0.5ml培养液，制成精子悬液。取另一支试管加入1ml培养液，将0.5ml精子悬液慢慢加入试管底部，形成上下二个两面。5CO2、37孵箱内静置1h。收集上游精子，备用,密度梯度离心法目的：利用不同成熟阶段的精子和各种细胞成分各自的密度，差异使之在不同浓度的溶液中，在离心力作用下停留在不同密度面的界面上，达到较好的分离。适用于精液粘稠、严重少精 弱精症。 *标准二层Puresperm法(80%、40%) 方法在锥形离心管底依次加入1.52ml 80、40 Puresperm液。将2ml精液加到40 Puresperm液界面上，离心300

10、g20”弃上层液体、留沉淀物、加5ml Puresperm wash、离心500g10同法洗涤2次留沉淀物，加0.5ml SpermAssist制成精子悬液备用。,精液分析在男性生殖力的评估中 起着极为重要的作用,但是不同实验室 测同一份样本的结果常有较大差异这说明男性学实验室各项指标 的质控是结果可信度的保证,男性学实验室质量控制规则随时样本结果的监测和对比；每周分析不同技术员所做的主要精液 指标的重复测量值；每月分析检测结果的月均值；每季校正加样器；每年校正计数板和其他设备。,质控图的基本控制原则 控制原则 误差敏感一个结果超出处置限 随机误差或系统误差连续两个结果都超出警戒上限 系统误差

11、或低于警戒下限连续两个结果,一个高于警戒上限, 随机误差一个低于警戒下限连续八个结果全部高于或低于均值 系统性误差,精子体外存活试验 液化精液1：3加入培养液50010 离心去上清液，重复洗涤一次。 留沉淀物制成1ml精子悬液，再加入2ml培养液使其形成上下二层界面，37、5CO2孵箱中静置1小时。 吸取上清夜，调节上游精子密度105106/ml，活率95。37、5CO2孵箱内培养3天，活率70%。,培养液、一次性耗材质量检测,小鼠2-细胞胚胎发育实验常规促排卵方法处理雌性KM小鼠，注射HCG后雌雄1:1合笼，第二天阴栓阳性的雌鼠留用。实验前一天，分组准备培养液，并设对照组。标记后置37, 5%CO2培养箱平衡过夜。注射hCG 42h左右，颈椎脱臼法处死已见栓雌鼠，无菌条件下获取2-细胞胚胎，随机分组，每组至少有胚胎20个。37, 5%CO2培养箱中培养，培养72h记录已充分扩展的囊胚数。如囊胚形成率75%，或与对照组囊胚形成率间无统计学差异，则培养液合格。,