纽虫铁蛋白的原核表达和抗重金属研究【开题报告】.doc

1、毕业论文开题报告生物技术纽虫铁蛋白的原核表达和抗重金属研究一、选题的背景与意义纽虫是一类生活在浅海潮间带的无脊椎动物，在世界各地都有分布，它具有柔软、能伸展、无分节的身体，以及一个极具特征性的捕食器能够翻转的吻。当捕食的时候，吻外翻出去紧紧地裹住猎物，然后通过类似TTX（TETOTOXINLIKE）的毒素杀死猎物后将其吞入腹中。纽虫还有一个众所周知的特征就是它极强的再生能力，在受到外界刺激的情况下，纽虫的身体会自行断成几个部分，并再次长成完整的个体。另外纽虫耐饿性很强，在没有外来食物提供的情况下也能够存活相当长的时间。这是因为在它的肠道和体壁之间充满了能够储存大量油滴物质的组织细胞，推测在没有

2、食物来源的时候，其生命活动所需要的能量主要是通过这些油滴物质的代谢提供的。同时有研究表明，纽虫能积累CR、PB、ZN、CD和NI等重金属，且含量与暴露时间呈正相关，即随暴露时间的延长，重金属含量增加。另有研究表明，扁额原细首纽虫暴露在几种重金属的安全浓度下一段时间后，再将其投放到正常海水中，则其体内含量下降。这些均表明纽虫能适应外界环境中重金属含量的波动，且恢复实验显示，纽虫对重金属有净化能力。由于纽虫的这些独特的生理特点，其可被作为一类绝佳的生物研究模型，用来阐明生物体的脂肪代谢、再生、胚胎发育、重金属处理等重要生理现象的机理。本实验所用的纽虫是在浙江省东部奉化市沿海的虾塘中发现的，为一种中

3、间为肉红色,两端为橘红色的扁平且细,能在水里同蛇一样的侧泳动物。根据形态学、组织学、分子生物学研究结果将其定名为浙江枝吻纽虫（DENDRORHYNCHUSZHEJIANGENSIS）。本课题的研究内容为铁结合蛋白在纽虫中的表达特征，功能和作用机理，为进一步开发利用铁蛋白提高生物抵抗重金属的能力奠定基础。铁结合蛋白可以储藏结合4500个可溶、非毒性、可利用的铁原子,在生物体内铁的代谢方面起着关键作用。首先，能够将生物体内多余的铁离子储存起来，避免铁离子给机体造成伤害。第二，铁结合蛋白可以提供铁离子给所需要的细胞，用以合成相关的蛋白质和酶。另外，铁结合蛋白还能够减少生物体内活性氧分子的产生，从而使

4、其免受氧化损伤。因此我们设想并试图利用这一蛋白来提高生物对重金属污染的抵抗能力。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1、铁蛋白的原核表达（1）铁蛋白ORF的扩增和双酶切；（2）表达载体的双酶切；（3）目的片段与载体的连接，并转化到宿主菌株中；（4）IPTG诱导重组蛋白的表达，并通过电泳检测表达的情况；2、重组铁蛋白抗重金属活性的研究（1）用含不同浓度重金属的LB培养基培养菌株；（2）分析细菌的生长情况。拟解决的主要问题1、熟悉铁蛋白ORF的扩增和双酶切方法；2、将目的片段与载体连接后并成功的转化到宿主菌株中；3、诱导使重组铁蛋白表达，并检测其表达状况；4、配置含不同浓度的重金属的LB培

5、养基培养菌株，分析细菌的生长状况。三、研究的方法与技术路线四、研究的总体安排与进度200911200912查询与论文有关的资料、撰写试验计划、熟悉基本的实验操作；201003201006原核表达载体构建，进行铁蛋白原核表达实验；201009201012抗重金属活性的研究实验；201012201101实验的补充、完善阶段；设计引物PCR扩增产物双酶切切切切载体双酶切切连接转化ECOLIBL21（DE3）重组蛋白的诱导表达抗重金属活性检测201101201104外文的翻译和外文的撰写。五、主要参考文献吕慈仙，李太武，江锦坡，苏秀榕浙江沿海最新发现一种枝吻类纽虫J水产科学，2008,27126526

6、54尹左芬,曾棻纵沟纽虫科LINEIDAE、枝吻纽虫属（DENDRORHYNCHUS）的一新种湛江枝吻纽虫（DZHANJIANGGENSIS）的研究海洋通报,1984,365158ANDREWSSC,AROSIOPSTRUCTURE,FUNCTION,ANDEVOLUTIONOFFERRITINSJINORGBIOCHEM,1992,471161174AROSIOP,ROSARIAI,PATRIZIACFERRITINAFAMILYOFMOLECULESFORIRONSTORAGE,ANTIOXIDATIONANDMORE,BIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTA,2009,179

7、0589599AROSIOP,SONIALFERRITIN,IRONHOMEOSTASIS,ANDOXIDATIVEDAMAGEFREERADICALBIOLOGYMEDICINE,2002,334457463BAUMINGERER,HARRISONPM,HECHEL,D,ETALHOWDOESTHEFERRITINCOREFORMHYPERFINEINTERACTIONS,1994,91835839BEATRICEL,PAOLOS,THIERRYG,ETALCRYSTALSTRUCTUREANDBIOCHEMICALPROPERTIESOFTHEHUMANMITOCHONDRIALFERRI

8、TINANDITSMUTANTSER144ALAJMOLBIOL2004,340277293BUNKERJ,THOMASL,GARRETTD,ETALKINETICSTUDIESOFIRONDEPOSITIONCATALYZEDBYRECOMBINANTHUMANLIVERHEAVY,ANDLIGHTFERRITINSANDAZOTOBACTERVINELANDIIBACTERIOFERRITINUSINGO2ANDH2O2ASOXIDANTSBIOPHYSICALCHEMISTRY,2005,114235244ELIZABETHCT,TAKAGIH,SMALLGW,ETALTHEFERRIT

9、INIRONENTRYANDEXITPROBLEMINORGANICACHIMICAACTA,2000,297242251FUJIIS,ATSUSHIA,MASAHIROM,ETALFERRITINASABIONANOPARTICULATEEMULSIFIERJOURNALOFCOLLOIDANDINTERFACESCIENCE,2009,338222228FRANCOISER,ABDELKY,BERNARDGASECONDFERRITINLSUBUNITISENCODEDBYANINTRONLESSGENEINTHEMOUSEMAMMALIANGENOME,1992,2143149HARRI

10、SONPM,PAOLOATHEFERRITINSMOLECULARPROPERTIES,IRONSTORAGEFUNCTIONANDCELLULARREGULATIONBIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTA,1996,1275161203HEMPSTEADPD,STEPHENJY,ALISDAIRRF,ETALCOMPARISONOFTHETHREEDIMENSIONALSTRUCTURESOFRECOMBINANTHUMANHANDHORSELFERRITINSATHIGHRESOLUTIONJMOLBIOL,1997,268424448JUANSH,JIAHG,ANDSTEV

11、ENDALOADINGOFIRONINTORECOMBINANTRATLIVERFERRITINHETEROPOLYMERSBYCERULOPLASMINARCHIVESOFBIOCHEMISTRYANDBIOPHYSICS,1997,341280286JUANSH,JIAHG,ANDSTEVENDALOADINGOFIRONINTORECOMBINANTRATLIVERFERRITINHETEROPOLYMERSBYCERULOPLASMINARCHIVESOFBIOCHEMISTRYANDBIOPHYSICS,1997,341280286KIMBS,CHANGSL,CHIYY,ETALCH

12、ARACTERIZATIONANDIMMUNOLOGICALANALYSISOFFERRITINFROMTHEHEMOLYMPHOFGALLERIAMELLONELLACOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGY,PARTB,2001,129501509KIMSR,KWANGSL,HYUNGJY,ETALMOLECULARCLONING,EXPRESSIONANDCHARACTERIZATIONOFCDNASENCODINGTHEFERRITINSUBUNITSFROMTHEBEETLE,APRIONAGERMARICOMPARATIVEBIOCHEMISTRYAN

13、DPHYSIOLOGY,PARTB,2004,138423433KIMTY,ILJJ,SHINYK,ETALPARAGONIMUSWESTERMANIMOLECULARCLONING,EXPRESSION,ANDCHARACTERIZATIONOFARECOMBINANTYOLKFERRITINEXPERIMENTALPARASITOLOGY,2002,102194200LEVY,F,RABEL,D,CHARLET,M,ETALPROTEOMICANALYSISOFTHESYSTEMICIMMUNERESPONSEOFDROSOPHILAJBIOCHIMIE,2004,86607616MASU

14、DAT,FUMIYUKIG,TOSHIHIROY,ETALCONSTRUCTIONOFHOMOANDHETEROPOLYMERSOFPLANTFERRITINSUBUNITSUSINGANINVITROPROTEINEXPRESSIONSYSTEMPROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION,2007,56237246MASUDA,T,GOTO,F,YOSHIHARA,T,ETALCONSTRUCTIONOFHOMOANDHETEROPOLYMERSOFPLANTFERRITINSUBUNITSUSINGANINVITROPROTEINEXPRESSIONSYSTEMJPR

15、OTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION,2007,56237246OMIYA,S,HIKOSO,S,IMANISHI,Y,ETADOWNREGULATIONOFFERRITINHEAVYCHAININCREASESLABILEIRONPOOL,OXIDATIVESTRESSANDCELLDEATHINCARDIOMYOCYTESJMOLECULARANDCELLULARCARDIOLOGY,2009,465966RECALCATS,INVERNIZZIP,AROSIOP,ETALNEWFUNCTIONSFORANIRONSTORAGEPROTEINTHEROLEOFFER

16、RITININIMMUNITYANDAUTOIMMUNITYAUTOIMMUNITY,2008,308489RECALCAT,S,INVERNIZZI,P,AROSIO,P,ETALNEWFUNCTIONSFORANIRONSTORAGEPROTEINTHEROLEOFFERRITININIMMUNITYANDAUTOIMMUNITYJAUTOIMMUNITY,2008,308489SHIGEMIKIO,HIKOSOS,IMANISHIY,ETALDOWNREGULATIONOFFERRITINHEAVYCHAININCREASESLABILEIRONPOOL,OXIDATIVESTRESSA

17、NDCELLDEATHINCARDIOMYOCYTESJOURNALOFMOLECULARANDCELLULARCARDIOLOGY,2009,465966STEFANIA,R,PIETRO,I,PAOLO,A,ETALNEWFUNCTIONSFORANIRONSTORAGEPROTEINTHEROLEOFFERRITININIMMUNITYANDAUTOIMMUNITYJJOURNALOFAUTOIMMUNITY,2008,308489THEILLFERRITINSTRUCTURE,GENEREGULATION,ANDCELLULARFUNCTIONINANIMALS,PLANTS,ANDM

18、ICROORGANISMSANNREVBIOCHEM,1987,56289315WANGX,BAOZHONGL,JIANHAIXCLONING,CHARACTERIZATIONANDEXPRESSIONOFFERRITINSUBUNITFROMCLAMMERETRIXMERETRIXINDIFFERENTLARVALSTAGESCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGY,PARTB,2009,1541216ZHOUJ,WANGWN,MAGZ,ETALGENEEXPRESSIONOFFERRITININTISSUEOFTHEPACIFICWHITESHRIMP,LITOPENAEUSVANNAMEIAFTEREXPOSURETOPHSTRESSAQUACULTURE,2008,275356360ZHOU,J,WANG,WN,MA,GZ,ETALGENEEXPRESSIONOFFERRITININTISSUEOFTHEPACIFICWHITESHRIMP,LITOPENAEUSVANNAMEIAFTEREXPOSURETOPHSTRESSAQUACULTURE,2008,275356360