三疣梭子蟹球状病毒的纯化与人工感染【开题报告】.doc

1、毕业论文开题报告生物技术三疣梭子蟹球状病毒的纯化与人工感染一、选题的背景与意义三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS隶属于甲壳纲CRUSTACEA、十足目DECAPODA、梭子蟹科PORTUNIDAE，广泛分布于我国沿海，是一种经济价值较高的大型海产经济蟹类。三疣梭子蟹肉味鲜美，营养丰富，是人们极为喜爱的水产品，同时也是重要的出口创汇品种，已逐渐成为我国海水养殖的主导品种之一。目前,我国沿海各省均开展了三疣梭子蟹人工养殖,尤其浙江省沿海地区养殖发展迅速，舟山市一带短短几年就发展成了全国闻名的梭子蟹养殖基地。随着三疣梭子蟹养殖业的快速发展，养殖规模不断扩大，养殖密度不断增加，而

2、又因其受海洋环境污染、养殖生产自身带来的污染、养殖技术等多方面的原因制约，三疣梭子蟹的养殖过程中病害问题也日趋突出。各种疾病的发病率和危害程度有逐年上升的趋势，并呈现出大规模发生和暴发性流行的趋势。不但提高了水产养殖的投入产出比，危害水产养殖业者的经济利益，且由于对病原不了解而盲目用物，导致药物滥用，打击了消费信心，影响到出口内销，严重困扰着梭子蟹水产养殖业的健康发展。另外由于一些虾蟹综合养殖的推广，一些广宿主病毒如白斑综合症杆状病毒等也成为侵害三疣梭子蟹的病原体。三疣梭子蟹产业化人工养殖中，病害防治是最重要的环节，是核心问题，而这恰恰是目前最薄弱环节。而蟹类病毒性病原研究更是极其薄弱。国内外

3、已报道的蟹类病毒有类呼肠孤病毒、微核糖核酸病毒、蓝蟹疱疹病毒、蓝蟹螺旋病毒、河蟹颤抖病毒及锯缘青蟹杆状病毒等。对蟹类病毒的研究多集中在形态观察水平上，尚未进行分子鉴定及灵敏检测方法构建。国内外有关三疣梭子蟹病毒研究的文献极少，对三疣梭子蟹病毒的病原和病理研究也尚不深入。其中以对虾白斑症病毒（WSSV）研究相对透彻白斑综合症病毒WHITESPOTSYNDROMEVIRUS,WSSV是对虾白斑综合症的病原体,同时也是导致三疣梭子蟹大量死亡的主要传染性病毒之一，具有宿主范围广、传播快、感染后死亡率高等特点，国内一些研究所通过实时荧光定量PCR测定试验蟹体内各器官中WSSV含量,病理切片观察濒死蟹各器

4、官组织病理改变的方法，对WSSV进行了系统的研究。近年来，梭子蟹养殖中大规模爆发性死亡现象的时有发生，至今还未得到微生物学、分子生物学、免疫学的明确鉴定。此类不明病害严重威胁着我国梭子蟹蟹类养殖业。通过对宁海三疣梭子蟹发生秋季大规模死亡样品的病理观察，发现组织细胞中存在大量球状病毒。我们拟对人工养殖过程中的三疣梭子蟹秋季大量死亡的病样进行病毒纯化，对纯化的病毒进行形态观察，并用病毒对健康蟹进行人工感染研究，以期为三疣梭子蟹病毒病害快速诊断、防治提供理论与技术支撑。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1建立由三疣梭子蟹感染组织纯化球状病毒的技术方法A采集患病三疣梭子蟹B研制合适的缓

5、冲液C将病样在缓冲液中匀浆，后建立多步骤差速离心纯化病毒的技术，摸索、优化纯化条件D对纯化的病毒进行负染、电镜观察其形态特征2三疣梭子蟹球状病毒的人工感染研究A由病样粗提病毒，细菌滤器过滤后，注射健康梭子蟹，观察感染、死亡情况B对人工感染发病的梭子蟹，抽样解剖、固定后制作超薄切片电镜观察。拟解决的主要问题1建立由三疣梭子蟹感染组织纯化球状病毒的技术方法2确定三疣梭子蟹球状病毒的致病力三、研究的方法与技术路线1采集发病梭子蟹，在缓冲液中匀浆，差速离心纯化病毒，对纯化的病毒进行负染、电镜观察，重复实验，摸索、优化相关纯化条件。2由发病梭子蟹粗提病毒，细菌滤器过滤后，注射健康梭子蟹，观察、记录其感染

6、、死亡情况。对人工感染发病的梭子蟹，抽样解剖、固定后制作超薄切片电镜观察判断其细胞中是否存在相应病毒。研究技术路线四、研究的总体安排与进度201011201012查阅文献，撰写开题报告和综述，熟悉实验操作；201012201101翻译二篇外文文献；201101201102样品采集，病毒纯化；201102201104人工感染三疣梭子蟹，对发病的三疣梭子蟹组织切片后电镜观察；201104201105实验数据的整理、分析，撰写论文，结题、答辩。五、主要参考文献1阎斌伦，梁利国，张晓君三疣梭子蟹主要病害研究进展J水产科技情报，2010129372KAZUOMOMOYAMA，MIDORIHIRAOKA，

7、VENEGASETALPATHOGENICITYOFPENAEIDRODSHAPEDDNAVIRUSPRDVTOJUVENILESOFSIXCRUSTACEANSPECIESC4SYMPONDISEASESINASIANAQUACULTUREDAAIV，CEBUCITYPHILIPPINES1999，2226NOV3肖国华，赵春龙，崔兆进三疣梭子蟹人工育苗及养成病害发生的主要原因及防治方法J齐鲁渔业，2006，取病样匀浆差速离心纯化病毒细菌滤器过滤用滤过液人工感染健康蟹，观察发病死亡情况对纯化的病毒负染人工感染发病的组织制作超薄切片统计分析电镜下观察病毒形态电镜下观察病毒感染情况，确定其致病力

8、23336374王亚维三疣梭子蟹人工育苗中丝状菌病和粘污病的防治M养殖技术，20062415MONTANIEH，BONAMIJR，COMPSMIRIDOLIKEVIRUSINFECTIONINTHECRABMACROPIPUSDEPURATORLCRUSTACEA,DECAPODAJJINVERTEBRPATHOL，1993，613203226王光宇三疣梭子蟹的健康养殖和白斑病毒病的防治J水产科技情报，2005，3252212227王忠发，王志铮，许文军虾蟹混养塘中WSSV对三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS致死效应的定量研究J海洋与湖沼，2008，21841898MAR

9、IJ，BONAMIJRPC84，APARVOLIKEVIRUSFROMTHECRABCARCINUSMEDITERRANEUSPATHOLOGICALASPECTS，ULTRASTRUCTUREOFTHEAGENT，ANDFIRSTBIOCHEMICALCHARACTERIZATIONJJINBERTEBRPATHOL，1988511451569徐国成，阎斌伦，徐加涛虾蟹拟阿脑虫病的防治研究M水利渔业，200626959710施慧，许文军，徐汉祥三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫PCR检测方法的建立J上海水产大学学报，200817283311王希升，曹建亭，李欣，等才女虫对三疣梭子蟹育苗的影响M齐鲁渔业

10、200828444512王建平，余晓巍，周志强，等宁波市三疣梭子蟹主要病害流行特征及应对措施M河北渔业20O89495313赵春民三疣梭子蟹亲蟹培育过程中“掉腿病”的防治J科学养鱼，200845214何伟贤三疣梭子蟹鳃病的病因与防治J渔业现代化，20034242515丁朋晓，张连英养殖蟹类病害的研究进展M畜牧与饲料科学，201031333516王高学，黄增荣，顾忠旗三疣梭子蟹“牛奶病”的流行病学调查与防治技术上M科学养鱼，200728317王国良，金珊，李政，等三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS乳化病的组织病理和超微病理研究J海洋科学，2006，43718陈寅儿，王国良，

11、金珊，等三疣梭子蟹肌肉乳化病的同工酶病理变化研究M海洋科学，200832363919许文军，徐汉祥，施慧，等梭子蟹假丝酵母菌病初步研究M水产学报，20052983183620许文军，徐汉祥，施慧三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUSMIERS血卵涡鞭虫病诊断与综合防治措施M现代渔业信息，2006，211121王广成，赵炳然，王权，等对越冬期三疣梭子蟹拟阿脑虫病的初步研究J齐鲁渔业，2005，223333422陈寅儿，王国良，金珊，等梭子蟹乳化病病原菌联合药敏实验M水利渔业，200626131523王世党，周维武，宋宗岩，等文登市中国对虾白斑病发病监测及分析J齐鲁渔业，2002191024侯传宝梭子蟹育苗中“红圈病”防治初探M渔业致富指南，200724125许文军，徐汉祥，金海卫梭子蟹“乳化病”病原的研究J浙江海洋学院学报，200322209213