三疣梭子蟹蜕皮抑制激素基因的组织表达【开题报告】.doc

1、毕业论文开题报告生物技术三疣梭子蟹蜕皮抑制激素基因的组织表达一、选题的背景与意义三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS），隶属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。其生长迅速，养殖利润丰厚，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。梭子蟹一般在35米深海底生活及繁殖，冬天移居到1030米的深海，喜在泥沙底部穴居。由X器窦腺复合体合成和分泌的蜕皮抑制激素被认为是甲壳动物十足目中涉及蜕皮控制的激素。现在普遍接受的一个说法，蜕皮抑制激素抑制Y器中蜕皮激素的合成从而抑制蜕皮。近些年来，甲壳动物中有很多物种的MIH序列已经被测定凡纳对虾、刀额新对虾、日本对虾、黄道蟹。对甲壳

2、动物蜕皮周期中眼柄内编码的MIH进行NORTHEM印迹，发现MIH的MRNA水平在蜕皮前期逐渐降低，最低点出现在蜕皮晚前期，在蜕皮后水平突然升高，在蜕皮间期持续升高，从而说明了MIH的生理功能。当前，国内外都有对蟹类MIH基因研究的报道，LEE等已经在蟹类中将MIH基因克隆出来；王在照等采用RTPCR技术已经可以得到中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSIS）MIH基因的CDNA片断；宋霞等运用RTPCR和3RACE技术克隆了中华绒螯蟹MIH基因的CDNA片断。朱冬发等对三疣梭子蟹三疣梭子蟹蜕皮抑制激素CDNA的克隆与序列分析。不过很少看到关于MIH基因在组织中表达的文章。作为在蟹类蜕皮中

3、扮演重要角色的MIH，我们需要对其合成及作用机制有一个透彻的了解。三疣梭子蟹遇到的性早熟的问题会给很多养殖户早成了重大的经济损失。所以研究清楚性早熟的机理然后解决这个问题刻不容缓。虽然目前我们已经知道MIH是作用于Y器然后抑制蜕皮激素的分泌，但是并没有一个明确的对它的机制的了解。对三疣梭子蟹MIH基因的组织表达的研究，旨在为进一步阐明蟹类蜕皮机制、解决生产实践中遇到的性早熟和蜕皮未遂问题打下基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1、对三疣梭子蟹以下器官中蜕皮抑制激素基因的表达进行研究X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑、Y器2、对三疣梭子蟹上述器官蜕皮抑制激素基因的

4、表达量进行研究拟解决的问题三疣梭子蟹实验器官中蜕皮抑制激素基因定性、定量的表达情况三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1、实验材料在宁波宁海长街得水育苗场购得三疣梭子蟹。选取生长旺盛体重在4080G之间，头胸甲宽为812CM之间的三疣梭子蟹，然后取分别取出X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑、Y器，取出后迅速转移到液氮中保存。2、总RNA提取（1）超低温冷冻总RNA提取样品，称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，期间不断加入液氮直至研磨成粉状；（2）想研钵中加入适量总RNAREAGANT将粉末状的样品覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，要用研钵继续研磨至透明状；（3）将匀浆液移至离

5、心管中，室温静置50MIN；（4）在4，12000转的条件下离心5MIN；（5）小心吸取上清液，移入新离心管中；（6）将上述离心液加入200L氯仿，震荡，待充分乳化至乳白状，静置5MIN；（7）在4，12000转的条件下离心15MIN；（8）吸取上清液300L400L移至新的离心管中；（9）向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，在1530静置10MIN；（10）在4，12000转的条件下离心10MIN；（11）弃上清液，缓慢沿管壁加入75乙醇1000L，轻轻上下颠倒洗涤，离心管壁，在4，12000转的条件下离心5MIN，后弃乙醇，干燥25MIN；（12）加入适量RNASEFREEH2

6、O（大约2050L）3、第一链CDNA合成每个MRNA样品取10G，5PRIMESCRIPTBUFFER2L，PRIMESCRIPTRTENZYMEMIXI05L，OLIGO（DT）PRIMER（50MOL/L）05L，RANDOM6MERS（100MOL/L）05L，用RNASEFREEDH2O补足10L。具体操作参照PRIMESCRIPTRTREAGENTKIT说明书。4、荧光定量PCR荧光定量PCR在MASTERCYCLEREPREALPLEXREALTIMEPCREPPENDORF上完成，25LPCR的反应体系包括SYBRPREMIXEXTAQII2缓冲液125L，正向和反向引物10M

7、OL/L各05L（参见表1），CDNA模板1L，DH2O105L。程序采用三步法为9530S1个循环，随后进行40个循环，每一循环包括，955S，5530S，6830S。PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析，以确保特异性扩增，条件是9530S，55S，9515S1个循环从55上升到95的过程耗时20MIN。实验结果采用仪器自带程序读取。表1内参基因与目的基因的引物序列基因引物序列预期产物大小BP18SRRNA5TTGGTGGAGCGATTTGTCTGG35AGAAGAAGCTGCGAACTGGAC3350ACTIN5CCTGACTGCCTACCTCACCAA35ATGCCGACAGATTCC

8、ATACCC3350MIH5GACGCTTTTCAGATCCGGCC35GCCTGTGCCAGTCGTCAGAGG3110（二）技术路线四、研究的总体安排与进度201010毕业论文选题201010201011进行文献查阅和资料收集201011201012完成任务书、开题报告、综述，进行开题答辩2011120112完成两篇外文文献的翻译2011220114进行论文实验，然后再把实验的数据整理，完成毕业论文20115进行毕业答辩五、主要参考文献1SIUMINGCHAN,XIAOGUANGCHEN,PEILIGUPCRCLONINGANDEXPRESSIONOFTHEMOLTINHIBITINGHO

9、RMONEGENEFORTHECRABJGENE,1998,22423332WEIQUNLU,GEOFFREYW,LISAAO,ETALCHARACTERIZATIONOFCDNAENCODINGMOLTINHIBITINGHORMONEOFTHECRAB,提取需要实验的各个器官利用PRIMESCRIPTRTREAGENTKIT说明书合成CDNA。提取其中的MRNA荧光PCR检测部分组织蜕皮抑制激素基因的表达量设计引物CANCERPAGURUSEXPRESSIONOFMIHINNONXORGANTISSUESJGENE,2001,27814931593梅英综,刘长安,龚建平定量PCR的研究进展

10、J国外医学临床生物化学与检验学分册,2004,25123274邱高峰,张爱萍,楼允东等锯缘青蟹蜕皮抑制激素CDNA的分子克隆及其表达分析J水产学报,2003,2732072125朱冬发,沈建明,杨济芬,等三疣梭子蟹蜕皮抑制激素CDNA的克隆与序列分析J动物学报,2008,546111211186王在照,焦传珍,张晓军等中国对虾蜕皮抑制激素全长CDNA的克隆及序列分析J遗传学报,2003,3021281347宋霞,周开亚,马长艳中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1ERSMIH1基因组DNA的分子克隆和序列分析J动物学报,2004,50183908蔡刚,李闻捷,沈茜实时定量PCR应用中的问题及优化方案XJ国外医学临床生物化学与检验学分册,2003,246,3303329张蓓,沈立松审校实时荧光定量PCR的研究进展及其应用J国外医学临床生物化学与检验学分册,2003,24632732910欧阳松应,杨冬,欧阳红生等实时荧光定量PCR技术及其应用J生命的化学,2004,241747611应雪萍,杨万喜,许捷中华绒螯蟹不同生理阶段复肢的结构变化及粘液腺的发育特征J,2004,25325626212郭慧芝,付建平,昌鸣先等中华绒螯蟹铁蛋白基因的克隆及表达分析,水产学报,2010,346905912