鮸鱼Vibrio ponticus的分离鉴定【开题报告】.doc

1、毕业论文开题报告水产养殖鮸鱼VIBRIOPONTICUS的分离鉴定一、选题的背景与意义鮸鱼（音MIN），一作米鱼，形似鲈鱼，但肉质略粗糙，体色发暗，灰褐并带有紫绿色，腹部灰白。背鳍鳍棘上缘黑色，鳍条部中央有一纵行黑色条纹。胸鳍腋部上方有一晴斑。其余各鳍灰黑色。鮸鱼体形为两侧扁平向后延长状，背、腹部浅弧形。鮸鱼分布于北太平洋西部，包括中国的渤海、黄海及东海，朝鲜和日本南部。中国沿海主要产鮸鱼的渔场有广东潮汕鱼场福建平潭岛和兄弟岛，浙江岱山和舟山群岛，江苏大沙渔场，山东沿海和渤海，尤以东海的舟山群岛产量最大，是宁波一带的海渔特产之一。鮸鱼的主要捕捞方法为底拖网或延绳钓，冬春之际产量较高。每年农历6

2、一8月为舟山群岛鮸鱼的渔汛期，渔汛期鮸鱼以春季生殖洄游和冬季越冬洄游为主，7月为旺汛。每逢大潮汛，渔船竞相出海作业，晨出晚归，捕获甚丰。鮸鱼肉味鲜美，为海产经济鱼类之一，也是经济价值较高的鱼类。除鲜食外，肉是作鱼丸、敲鱼面的上等原料，在温州颇有盛名；全鱼还可制作罐头或加工成鮸鱼鲞；鱼鳔可制鱼胶，有较高的药用价值，具养血、补肾、润肺健脾和消炎作用；鱼鳞可制鳞胶；内脏、骨可制鱼粉、鱼油；耳石有清热去瘀、利尿的作用。鮸鱼还是我国的出口鱼类品种，每年通过浙江、上海、江苏、辽宁等出口口岸大量输往日本、香港、澳门等国家和地区。鮸鱼性甘、咸、平，有养血、止血、补肾固精、润肺健脾和消炎功效。对治疗再生障碍性贫

3、血，吐血，肾虚遗精，疮疖、痛肿、无名肿毒、乳腺炎等有效。鮸鱼的耳石有清热去瘀、利尿的作用；鮸鱼鳔俗称“鮸鱼胶”或“鳘肚”，具有养血、补肾、润肺健脾和消炎作用；采用鮸鱼鳔，与当归、红枣适量煎汤，长期坚持食用，对再生障碍性贫血有一定疗效。鮸鱼鳔与等量的酒和水炖食，可治疗男子遗精和女子白带。VIBRIOPONTICUS是弧菌属的一员，2004年发现的一个新种。在鱼类弧菌病前期研究中，溶藻弧菌、创伤弧菌、鲨鱼弧菌、哈维氏弧菌等是危害鱼类生长的重要病原，主要导致鱼体表溃疡或是烂身、烂鳃。近2年出现的VIBRIOPONTICUS病的主要症状同以往不同，主要表现为病鱼离群独游，体色发黑或体表粘附大量黄色物质

4、，体表正常，无溃烂症，肝偏白，鳃偏白，有一定的失血症状，肠空，部分鱼肠有脓液，无味。该菌可感染幼鱼，也可感染2龄以上的鱼，发病急，一般在1周内死亡5080，死亡1周后鱼死亡变缓，逐渐稳定。发病一般在春、秋2季，水文变化较多的季节。VIBRIOPONTICUS也可感染日本海鲈（LATEOLABRAXJAPONICUS），但症状不同，可使日本海鲈体表溃疡和肝损伤。治疗1、由于VIBRIOPONTICUS病发生时，鱼已拒食，可重点对尚可摄食的鱼进行重点预防，用终浓度02PPM的氟苯尼考或04PPM的恩诺沙星拌饲投喂，连用3天，有较好的预防效果。意义通过此次试验，可以研究引起鮸鱼病变的细菌并把它进行分

5、离鉴定，为下一步的治疗等研究做准备。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容本实验主要是对引起鮸鱼致病的病菌进行分离，采用了TCBS平板分离优势菌；采用了回归感染试验确认病原菌，采用改进的寇氏法计算LD50采用形态学观察，生理生化特征测定，细菌特异性引物PCR扩增检测及细菌16SRRNA序列分析鉴定细菌；采用药敏试验测定它对部分抗生素的敏感性。拟解决的问题研究引起鮸鱼病变的细菌并把它进行分离鉴定。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法本实验主要是对引起鮸鱼致病的病菌进行分离，采用了TCBS平板分离优势菌；采用了回归感染试验确认病原菌，采用改进的寇氏法计算LD50采用形态学观察，生理生

6、化特征测定，细菌特异性引物PCR扩增检测及细菌16SRRNA序列分析鉴定细菌；采用药敏试验测定它对部分抗生素的敏感性。11材料11主要试剂和仪器T4DNA连接酶、PMD19T载体和EXTAQDNA聚合酶等均购自TAKARA公司；UNIQ10柱式胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；其余药品试剂均为进口分析纯。药敏纸片购自杭州天河生物制药厂。离心机（MICROCL19型）购自THERMOELECTRON公司，PCR仪（MASTERCYCLEPEREONAL型）购自EPPENDORF公司，恒温震荡器（HZ9211K型购自太仓市科教器材厂。12样品选取症状典型的濒死病鱼。13引物采用已报道的细

7、菌16SRRNA基因通用扩增引物和部分弧菌科成员鉴定引物，进行PCR扩增验证。引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成。2病原菌的分离无菌条件下取病鱼体表溃疡、肝、脾、肾等部位作为材料，用普通营养琼脂和TCBS平板做细菌分离，置28C培养24H。结果从被检材料中分离到纯度一致的菌株，命名为鮸鱼病原菌,纯培养后70W保存备用。3菌体形态观察及常规生理生化鉴定用普通光镜和透射电镜结合观察分离细菌的形态、大小和鞭毛。参照常见细菌系统鉴定手册和伯杰氏细菌学鉴定手册方法对其进行生理生化特征测定。4病原菌的回归感染将鮸鱼病原菌接种于普通营养肉汤中，28C恒温过夜培养，用无菌生理盐水稀释至所需浓度平板菌落计数

8、法计算菌悬液浓度）。选择无外伤、游动活泼，平均体重45G左右的健康鮸鱼作为供试鱼。驯化7D后，经腹腔注射的方式进行人工感染。实验共分6个组，每组12尾鱼，其中5个实验组，1个对照组。实验组每尾注射01ML菌液，对照组每尾注射等量的无菌生理盐水。实验期间不投喂饲料，不间断充气，控制水温为（201C。感染开始后，记录96H内发病症状和死亡情况，采用ALIU和NMIDE改进的寇氏法（KARBERSMETHOD计算半数致死剂量。对死亡鱼体进行解剖和病原菌的再分离，对优势菌株进一歩完成生化特性的测定。5药物敏感性实验用药敏纸片法在普通营养琼脂平板上测定鮸鱼病原菌对药物的敏感性。28C恒温培养1618H，

9、观测抑菌圈直径大小，根据说明书标准判断药物敏感和抗药性。6细菌基因组序列扩增、测序和分析61细菌基因组DNA提取采用WILSON描述的方法提取鮸鱼病原菌的基因组DNA作为模板。62PCR扩增25UL的PCR反应体系中包括DNA模板05UL，10EXPCR缓冲液25UL，DNTP混合物（各25MOL/L2IL,正向和反向引物（10PMOL/L各1FIL和EXTAQDNA聚合酶1U。PCR反应条件为94C预变性2MIN后以下列程序进行30个循环，每个循环包括94C变性30S,5560度复性90S，72度延伸30S16SF/16SR引物扩增时为90S，循环结束后72C延伸10MIN。63扩增产物的检

10、测和克隆琼脂糖凝胶检测PCR产物，预期大小的扩增条带回收后克隆至PMD19T载体，序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。64序列分析采用CLUSTALW程序进行多重序列比对后，用MEGA40软件构建系统进化树。（二）技术路线选取症状典型的濒死病鱼病原菌的分离病原菌试验菌体形态观察及常规生理生化鉴定病原菌的回归感染药物敏感性实验细菌基因组序列扩增、测序和分析确认病原菌基因序列分析鉴定细菌对部分抗生素的敏感性四、研究的总体安排与进度2010120103毕业论文选题2010320107进行文献查阅和资料收集，制定具体研究计划和试验方案。2010720108试验相关仪器的采购和安装201082010

11、12病原菌的分离和各方面试验的进行。2011120112数据和材料整理、分析,完成2篇外文翻译。2011320114论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1林克冰,周宸,刘家富,等海水网箱养殖鮸鱼弧菌病的病原菌J台湾海峡,1999,33423452王军,苏永全,张朝霞,等闽南地区养殖鮸鱼细菌性疾病的病原生物学研究J厦门大学学报自然科学版,2001,40185913金珊,蔡完其,王国良,等养殖鮸鱼细菌性疾病的病原研究J浙江海洋学院学报自然科学版,2002,2132252304金珊,王国良海水网箱养殖鮸鱼弧菌病的流行病学研究J水产科学,2005,24117195毛芝娟,刘国勇,陈昌福鮸鱼溃疡病致病

12、菌的初步分离与鉴定J安徽农业大学学报,2002,2921781816李清禄,陈强海水网箱养殖鮸鱼细菌性病原鉴定与感染治疗研究J应用与环境生物学报,2001,754894937王军,鄢庆枇,苏永全,等溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测J海洋科学,2002,267148鄢庆枇,苏永全,王军,等鮸鱼弧菌病的荧光抗体快速诊断研究J集美人学学报自然科学版,2001,642912959姚斐,寇运同,陈刚,等间接免疫荧光抗体检测活的非可培养状态的副溶血弧菌J海洋科学,2000,249101210杨鸢劼,陈辉酶联免疫吸附法快速检测鳗弧菌J上海交通大学学报农业科学版,2005,231697611鄢庆枇,方恩华,鮸鱼

13、溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测J台湾海峡,2004,231566112王军,鄢庆枇,苏永全,等养殖鮸鱼副溶血弧菌的酶联免疫吸附法研究J台湾海峡,2001,20334635013RIVERAING,LIPPEK,GILAI,ETALMETHODOFDNAEXTRACTIONANDAPPLICATIONOFMULTIPLEXPOLYMERASECHAINREACTIONTODETECTTOXIGENICVIBRIOCHOLERAEO1ANDO139FROMAQUATICECOSYSTEMSJENVIRONMICROBIOL,2003,5759960614DONOVANTJANDVANNETTE

14、NPCULTUREMEDIAFORTHEISOLATIONANDENUMERATIONOFPATHOGENICVIBRIOSPECIESINFOODS数据整理，论文撰写ANDENVIRONMENTALSAMPLESJINTJFOODMICROBIOL,1995,261779115KIMYB,OKUDAJ,MATSUMOTOC,ETALIDENTIFICA2TIONOFVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSSTRAINSATTHESPECIESLEVELBYPCRTARGETEDTOTHETOXRGENEJJCLINMICROBIOL,1999,3741173117716LEECY,PAN

15、SF,LEEYS,ETALDETECTIONANDIDENTIFICATIONOFVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSINFAECALSAMPLESOFOUTBREAKPATIENTSBYINVITROAMPLIFICATIONOFTHERMOSTABLEDIRECTHAEMOLYSINGENEFRAGMENTJJCHINAGRICCHEMSOC,1994,32510311219CONEJEROMJUANDHEDRVDACTISOLATIONOFPARTIALTOXRGENEOFVIBRIOHARVEYIANDDESIGNOFTOXRTARGETEDPCRPRIMERSFORSPECI

16、ESDETECTIONJJAPPLMICROBIOL,2003,95360261120CONEJEROMJUANDHEDRVDACTPCRDETECTIONOFHEMOLYSINVHHGENEINVIBRIOHARVEYIJJGENAPPLMICROBIOL,2004,50313714221PANGL,ZHANGXH,ZHONGY,ETALAUSTINIDENTI2FICATIONOFVIBRIOHARVEYIUSINGPCRAMPLIFICATIONOFTHETOXRGENEJTHESOCIETYFORAPPLIEDMICROBIOL2OGY,LETTERSINAPPLIEDMICROBIO

17、LOGY,2006,43324925522DIPINTOA,CICCARESEG,FONTANAROSAM,ETALDETECTIONOFVIBRIOALGINOLYTICUSANDVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSINSHELLFISHSAMPLESUSINGCOLLAGENASETARGETEDMULTIPLEXPCRJJOURNALOFFOODSAFETY,2006,26215015923蒋鲁岩,陈光哲,祝长青,等应用地高辛标记的寡聚核酸探针检测副溶血弧菌J检验检疫科学,2002,124111224李宁求,白俊杰,吴淑勤,等斜带石斑鱼3种致病弧菌的分子生物学鉴定J水产学报,2005,29335636125张伟妮,周丽,邢婧,等养殖大菱虾腹水症病原菌SR1的分离及鉴定J中国水产科学,2006,13460360926KWOKAY,WILSONJT,COULTHARTM,ETALPHYLOGENETICSTUDYANDIDENTIFICATIONOFHUMANPATHOGENICVIBRIOSPECIESBASEDONPARTIALHSP60GENESEQUENCESJCANJMICROBIOL,2002,4810903910