食品毒理学食品毒理学实训.ppt

1、第四章 食品毒理学实训,实训一 实验动物的饲养管理实训二 实验动物分组、标记和染毒技术实训三 实验动物解剖和生物样本采集、制 备技术 实训四 小鼠急性毒性试验实训五 小鼠骨髓细胞微核试验实训六 小鼠精子畸变试验,实训一 实验动物的饲养管理,一、实训目的实验动物的饲养管理是保障食品毒理学动物实验的基础技术，通过本次实训了解实验动物房的环境要求及管理要点，掌握实验动物饲养管理的操作方法和程序，掌握实验动物健康的观察和评价方法。,二、仪器和材料小鼠、大鼠、兔、饲养盒、垫料、水瓶及辅助器材、开口器、体温表等,三、操作方法 1.大、小鼠的日常饲养管理 (1) 进入屏障动物房的准备 (2) 进入动物房后的

2、观察 (3) 大、小鼠的喂料 (4) 大、小鼠的喂水 (5) 大、小鼠换饲养盒 (6) 清洁卫生和消毒 (7) 记录,2.兔的日常饲养管理 (1) 工作人员进入兔室前须着工作服，穿胶鞋，戴口罩，戴手套、帽子。 (2) 进入兔室后先观察兔只健康状况，记录异常兔只并交由兽医师处置。 (3) 饮水 (4) 饲料 (5) 卫生消毒 (6)记录,3.实验动物健康的观察和评价（1）动物的外表与行为观察（2）个体检查（3）采食和饮水观察,四、实训结果1.计算动物一昼夜之内的摄食量和饮水量。2.对动物进行观察检查后，认真填写以下记录表，作出相应评价。,健康观察记录表动物品系：,综合评价： 观察人： 日期：,实

3、训二 实验动物的分组、 标记和染毒技术,一、实训目的实验动物科学的分组、标记和合理的染毒是取得良好试验结果和结论的前提，也是每一项毒理学试验首先要做的工作。通过本次试验掌握实验动物雌雄鉴别方法、科学分组、标记和常用基本染毒技术。,二、仪器和材料 1实验动物：成年健康小鼠、大鼠、豚鼠、家兔若干只。 2染料：结晶紫、苦味酸、品红。 3毛笔或棉签。 4动物称或天平 5灌胃针,三、操作方法和步骤(一)健康动物的选择和性别鉴定1.健康动物选择：2.性别鉴定： 大、小鼠；豚鼠；家兔。,（二)称重、分组与标记 1称重：根据不同试验要求，选择不同体重的动物。在同一组内，同性别动物体重差异应小于平均体重的10，

4、组间同性别动物体重均值应小于5。称量大、小鼠体重时天平的感量要求在0.1 g以下。,随机分组表,3.编号及标记（1）染色法。染料有苦味酸酒精饱和液(黄色)、甲基紫酒精饱和液(紫色)或美蓝溶液(蓝色)、0.5中性红或品红溶液(红色)等。具体方法：a.按右上肩、右肋、右后肢、颈部、背中、尾根、左前肢、左肋、左后肢顺序分别为1-9号，不染色为10号图4-1(a)；b.以头部为1号，按顺时针方向依次在右耳、右前肢、右后肢、颈部、背中、尾根、左耳、左前肢、左后肢染色，分别为2-10号图4-1(b) 。,图4-1大鼠和小鼠染色标号法,（2）耳缘孔口法。大、小鼠常用此法。在耳缘不同部位（图4-2)用针穿孔和

5、剪刀剪口，穿孔和剪口后，用墨黑酒精液涂抹，使其着色，不易脱失。常以右耳代表个位，左耳代表十位。孔表示1号、2号、3号和10号、20号、30号，一道口为4号、5号、6号和40号、50号、60号，二道口为7号、8号、9号和70号、80号、90号。穿孔和剪口配合，也可编1-99号，不穿不剪为100号。,图4-2 耳缘孔口标号法,（3）烙印法。适用于兔以上的动物。耳部消毒后，用刺数钳在动物耳上刺号，再以墨黑酒精液着色。也可用铸铁号码烧红后烙在动物体表部位，留下标记。这种方法可较长时间保留记号，适用于大动物标记。（4）号牌法。适用于大动物。将金属或塑料牌号固定在该动物的耳上或颈下，也可挂在饲养动物的笼上

6、。,（三)抓取和固定方法 1.小鼠 捉拿方法有二种：一种办法是用右手提起尾部，放在鼠笼盖或其它粗糙面上，向后上方轻拉，此时小鼠前肢紧紧抓着粗糙表面，轻轻抚摸，使安静，然后迅速用左手拇指和食指捏住小鼠双耳和颈背部皮肤，并以小指和手掌尺侧夹持其尾部固定于手中(如图4-3)；另一种抓法只用左手，先用食指和拇指抓住尾都，再用手掌尺侧及小指夹住尾根，然后用拇指及食指捏住其颈部皮肤。后者适于快速捉拿给药。,图4-3 小鼠抓取法 图4-4 大鼠抓取法,2大鼠 基本同小鼠，但大鼠牙齿很尖利，不要突然袭击式去抓。捉拿时右手慢慢伸向抓鼠尾，尽可能向尾根部靠近，将大鼠放在粗糙面上；左手戴防护手套，抓起其颈背部尽可能

7、多的皮肤并固定其头部以防咬伤(如图4-4)。也可将大鼠固定在固定器。注意捉拿时勿用剧烈动作激怒之。3豚鼠 以拇指和中指从豚鼠背部绕到腹下，另一只平托其臀部(如图4-5)。体重小时可用一只手捉拿，体重大时宜用双手。,4家兔 用右手大把抓住颈背部皮肤，轻轻提起，左手立即托住家兔的臀部或腹部，使其重量移向左手(图4-6)，这样既不伤害家兔，也避免兔抓伤人。捉家兔切忌只抓两耳。,图4-5 豚鼠抓取法 图4-6 家兔抓取法,（四)染毒方法 1大、小鼠灌胃法： 使用lmL注射器和灌胃针，用左手拇指和食指捏住大、小鼠两耳及头后皮肤，其余手指将大鼠或小鼠的背部皮肤和尾巴压在手掌间，使其躯干垂直，腹部朝内，头部

8、向上，略有一个倾斜度，固定好后，右手持注射器，将针头由动物口角插入口腔，避开牙齿，再从舌面沿咽后壁顺着吞咽动作徐徐滑入食道下端，遇有阻力时，可轻轻上下左右滑动，一旦感觉阻力消失，即可滑入胃内(如图4-5)。灌胃针插入深度，一般小鼠34cm，大鼠、豚鼠46cm。,2.小鼠腹腔注射法：左手紧握动物，右手将注射针头从左或右下腹部朝头部方向插入，针头与腹壁角度不宜太小，否则易人皮下。针头插人不宜太深或太近上腹部，以免刺伤内脏。(如图4-6)3.小鼠皮下注射法：可由两人合作，一人抓住小白鼠，另一人左手捏起背部皮肤，右手持注射器将针头刺人背部皮下。若熟练，也可一人操作(如图4-7)。,图4-5 小鼠灌胃法

9、 图4-6小鼠腹腔注射法 图4-7小鼠皮下注射法,4.小鼠尾静脉注射法：一人抓住小鼠，或将小白鼠置于固定器内，使鼠尾外露，用酒精棉球涂擦，或将鼠尾浸人50热水中0. 5min，使血管扩张。用左手拉住尾尖，选择一条扩张最明显、距尾尖1/4处的尾静脉，右手持带有4号针头的注射器刺人血管注射。如注射有阻力，且局部变白，应拔出针后，在第一次刺点的上方重新进行(如图4-8)。5.小鼠脑室注射法：由两人合作，一人固定好小鼠，另一人用眼科镊提起两耳连线中间处的皮肤，用手术剪快速剪去距镊尖0.3cm处的皮肤，暴露出颅骨。在距冠状缝和矢状缝各砰1.5mm左右处，先用小号钟表改刀(固定刀头深为2.0mm)在颅骨上

10、穿一小孔，然后将4号或5号针头垂直插入2-2.5mm，进行脑室注射(如图4-9)。,图4-8 小鼠尾静脉注射法 图4-9 小鼠脑室注射法,实训三 实验动物解剖和生物样 本采集、制备技术,一、实训目的实验动物解剖和生物样本采集、制备是毒理学研究中极为重要的基本操作技术，通过本次实训了解实验动物的内脏形态结构特征，掌握实验动物的处死方法、解剖技术，能辨认内部器官、正确分离组织器官；掌握血液采集方法、血清和血细胞分离技术，大鼠尿液收集方法、组织匀浆制备技术。,二、仪器和材料 (1)实验动物 成年健康小鼠、大鼠、家兔。 (2)器材 鼠笼，大鼠代谢笼，大、小鼠固定板。手术剪，镊子，儿科小骨钳，塑料离心管

11、(210 mL)，玻璃毛细管(内径l1.5mm)，注射器(1mL、2mL和5mL)，吸管，滴管，匀浆器。离心机，电子天平。 (3)试剂 抗凝剂(0.5肝素生理盐水溶液)；溶液(生理盐水或某种缓冲液)。 (4)其他 碘酒，酒精棉球，干棉球，滤纸。,1.采血 (1) 鼠尾采血 (4) 腹主动脉或股动(静)脉采血 (2) 眼眶静脉丛采血 (5) 断头采血 (3) 摘眼球采血 (6) 心脏采血,实验动物安全采血量,2血清与血细胞分离 (1) 血清的制备 将全血置37温箱保温lh，4冰箱中保存34h，以30004000rmin离心15min，取上清液低温保存备用。血清呈淡黄色，如呈淡红色或红色，表明有溶

12、血，可能影响许多指标的测定，一般应废弃。 (2) 血细胞分离 将血液采集在经抗凝剂处理的容器中，混匀，2000rmin离心20min，小心吸出血浆。血浆与红细胞之间有一薄层白细胞，需要时小心吸出置另一离心管中，不需要时可弃去。离心管中的沉淀为红细胞，加入等体积生理盐水，轻轻混匀，使红细胞悬浮，再次离心，弃上清液。如此重复3次，直至上清液无色透明为止，即获得红细胞。白细胞可依同法洗涤处理。,3尿液收集 (1) 代谢笼法 适用于大、小鼠，尿液通过代谢笼的大小便分离漏斗与粪便分开。因大、小鼠尿量较少，操作中有损失和蒸发可造成较大的误差，故一般要采集5h以上的尿液，取平均值。 (2) 反射排尿法 适用

13、于小鼠，提起小鼠，可反射性排尿。,4实验动物的处死方法 (1) 颈椎脱臼法： 多用于小鼠。 (2) 空气栓塞法：多用于兔、犬、猴等大动物。 (3) 断头法：用于大、小鼠、琢鼠。 (4) 急性放血法：用于大鼠、小鼠。 (5) 击打法：适用于较小的动物。 (6) 化学药物致死法：适用于各种动物。 (8) 其他：电击法、枪击法、微波法等。,5.实验动物的大体解剖 在实验动物处死后应立即解剖，越早越好。小鼠仰放在解剖盘上，用大头针固定住四肢，提起生殖器前方的皮肤，用剪子剪一小口，沿腹中线剪到颌下，把皮肤向两边分离。再剪开下腹部的肌肉，也沿中线剪开肌肉到胸骨下缘，向左侧剪断肋骨下端后，向前上方剪，直到断

14、开左边锁骨。剪时注意刀尖稍向上挑以免伤及内脏。右侧也同样处理后就可以揭去胸部前壁，这样就显示出其内部器官自然排列位置。将肝脏和胃向后推可见横膈，隔开胸腔和腹腔，中央为结缔组织的中央腱，其他部分为膈肌，为哺乳类所特有。观察心脏跳动情况以及肠蠕动的情况；观察有关脏器的外形和表面情况、颜色、边界和大小、质地、切面。 依次完整的取出腹腔脏器；胸腔脏器；肾脏和肾上腺；泌尿器官和生殖器官；颅腔脏器并对指定的脏器称重，并计算脏器系数。,6. 组织病理学检查常用部位有心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、睾丸、肠等。对指定的器官或组织用锋利的刀剪取材，应统一取材部位。组织块一般在10倍体积的10福尔马林中固定，此后常

15、规制片(组织石蜡包埋、切片、HE染色)。应详细记录显微镜下观察到的病变，并做出病理诊断。必要时，请其他的病理学家对有疑问的或有争论的发现进行复查。利用特殊染色、组织化学及电子显微镜技术研究毒作用机制。,7.组织匀浆的制备 (1) 动物处死 应根据试验要求选择合适的方法，如制备肺组织匀浆时不能用断头法处死，因易引起肺淤血(2) 脏器制备 动物处死后快速取出所需完整脏器，迅速置冰浴中，用冷生理盐水洗去血污，必要时用冷生理盐水灌流以除去血液。剥去脏器外膜，用滤纸吸干脏器表面水分，称重、定位留取所需组织备用或置冰箱(或液氮)中冻结保存。(3) 匀浆制备 定量称取脏器、剪碎，置匀浆机中，按设计要求加入一

16、定量比例的溶液(生理盐水、缓冲液、有机溶剂等)，在一定转速下研磨一定时间，有时需在冰浴中研磨，如制备肝匀浆S9上清液或分离细胞组分，全部操作均应在低温(010)下进行,四、实训结果(1) 数据记录，如下表所示，并计算脏体比（如肝体比、肾体比、脾体比等)。(2) 器官颜色和形态描述。,实训四 小鼠急性毒性试验,一、实训目的将外源化学物经口染毒求出LD50是毒理学研究中重要的基本技术和基础工作之一。通过该试验了解受试物的毒性大小、毒性特点及安全性，掌握改良寇氏法或霍恩氏法的试验设计及LD50的计算方法，掌握化学毒物的急性毒性分级标准和评价方法。,二、实训原理急性毒性试验的原理是动物一次或24h内多

17、次接触外源化学物后，观察急性毒性反应及其程度，以及中毒死亡的原因及特征，了解受试动物毒性反应的剂量-反应关系，求出LD50。,三、仪器和材料1体重l822g小鼠。 2灌胃针、注射器5套。325mL容量瓶、小烧杯各5个。410mL及lmL刻度吸管各5个。5饲养笼。6HgCl2粉末,四、操作方法及步骤(一)改良寇氏法(Karber) 1本次实验设5个剂量组(急性毒性试验一般设57个剂量组)，试验动物随机分到五组。2确定染毒剂量。经预试验知到HgCl2的0l00的致死剂量范围为8210mg/kg。 由r=lg-1(lgblga)/(n-1)，计算得r=2.27式中，r为各组剂量组公比。各组剂量按等比

18、级数递增，则各组正式剂量确定为：8，18.2，41.3，93.8，213mgkg。,3配制药液 按20mL/kg体重等容积灌胃。先从高剂量组配制，再按公比稀释配制各组药液(CCCCC)。那么C=213mg/kg20mL/kg=10.65mg/mL药液配制： a.配制25mLC即取HgCl2266.25mg定容至25mL。将C浓度依次释稀2.27倍。 b.配制C，把C稀释2.27倍。配制25mLC需C液 M=11mL4.计算每只动物实际灌胃量。每只小鼠实际灌胃量=0.02ml/g该鼠体重g,5. 灌胃。灌胃前应禁食4小时，空腹灌入，灌胃后34h再喂食。灌胃方法如实训二所述。若遇动物挣扎，应立即停

19、止进针或将针拔出，绝不可进针不顺而硬向内插，以免损伤或穿破食道或误入气管、肺，造成动物立即死亡。立即死亡的，要另补动物。 6观察记录,表4-9 急性毒性反应观察记录表,7.统计及计算（1）LD50=lg-1Xm-i(P-0.5) 式中 Xm：最大剂量组剂量对数值；i：相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数(相邻两组对数剂量的差值)；P：各组动物死亡率，用小数表示(如果死亡率为80应写成0.80)；P：各组动物死亡率之总和。（2）SlgLD50=i 式中 SlgLD50：lgLD50的标准误；p: 各组实验动物死亡率；q:各组实验动物存活率；n：实验动物组数。（3）LD50的95可信限=1g-1(

20、lgLD50士1.96SlgLD50) LD50的平均可信限= LD50士(LD50的95可信限的高限-低限)2,五、结果分析与毒性评价1.急性毒性分级,对人可能致死的估计量,表4-10 外源化学物急性毒性分级（WHO）,2.急性毒性评价 外源化学物的经口LD50 （1）大于10g/kg.bw，安全（2）大于人可能摄入量的10倍，有希望使用，应进入下一阶段试验（3）在人可能摄入量10倍左右，重复试验（4）小于人可能摄入量的10倍，放弃不用3.确定受试物HgCl2的毒性大小和安全性,实训五 小鼠骨髓细胞微核试验,一、实训目的学习小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核测定方法，了解化学毒物对骨髓细胞染

21、色体的损伤作用，掌握骨髓细胞微核测定的原理和操作方法。,二、实训原理微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。这种情况的出现往往是受到染色体断裂剂作用的结果。另外，也可能在受到纺缍体毒物的作用时，主核没有能够形成，代之以一组小核。此时小核往往比一般典型的微核稍大。,三、仪器和材料 (一)试剂 1.甲醇(分析纯)。 2.冰醋酸(分析纯)。 3.吉姆萨(Giemsa)储备液：称取Giemsa染料lg，逐渐加入少许甘油在研钵中研细

22、溶解，共加入66mL，甘油混匀，于60温箱中保温90min，冷却后再加入66mL甲醇混匀，于室温中静置12周，然后过滤，用棕色瓶贮存备用。4.吉姆萨(Giemsa)应用液取Giemsa贮备液1份，加pH6.8的磷酸缓冲液9份，混匀，临用时配制。 5.小牛血清。 6.pH6.8磷酸盐缓冲液：取甲液49.5ml,乙液50.5 ml混匀即可。 （1）甲液(即1/15mol/L Na2 HP04)：称取无水Na2 HP04 9.47g溶于l000mL蒸馏水中(Na2 HP04 ,若含有2、7或l2分子结晶水时，分别称取11.87g,17.87g或23.88g)。 （2）乙液(即1/15mol/L KH

23、2P04)：称取KH2P04 ，9.48g溶于l000mL蒸馏水中。 7. 受试毒物：环磷酰胺或丝裂霉素C,(二)器材 手术剪，晾片架，电吹风机，2mL注射器及针头，载玻片及推片，定时钟，止血钳，显微镜(具油镜头)，细胞计数器。,四、操作方法与步骤 1.动物选择：常用的实验动物为大、小鼠。以小鼠用得最多，要求体重1820g，712周龄。每组l0只左右。2.染毒次数与取样时间：采用多次染毒的方案。每天染毒一次，共4d，第5天取样。这样，仅取样一次就能覆盖2472h高峰，如果高峰延迟到96h也不会漏掉。故推荐以4次染毒后取样为常规方案。3.剂量选择：受试物的最大剂量除因溶解度所限外，应达最大耐受量

24、，或以该化合物的80LD50为最高剂量。在一般情况下，应设45或更多试验组，剂量水平跨3个以上数量级。另设阳性和阴性对照组。4.阳性对照：可用环磷酰胺(50100mg/kg)或丝裂霉素C(10mg/kg)。腹腔注射一次或二次均可。,（二）操作步骤 1.染毒：按确定途径给动物染毒，同时做阳性及阴性对照 2.涂片：用颈椎脱臼方法处死动物，四肢固定于解剖板，将腹中线被毛浸湿。剖开胸腹部，取下胸骨，剔去肌肉。将胸骨骨髓挤于有一滴小牛血清的载玻片上，推片。 3.固定：将推好晾干的标本玻片放入染色缸中用甲醇溶液固定15min，取出晾干。 4.染色：用新鲜配制的l0Giemsa染液(Giemsa原液l份加p

25、H6.8的磷酸盐缓冲液9份)染色l015min。冲洗后晾干。 5.观察计数：先在低倍镜下观察，选择分布均匀、染色较好的区域，再在油镜下观察计数。PCE细胞呈灰蓝色，一个细胞内可出现一个或多个微核；NCE呈橘黄色，无核。微核发生率（）=含微核的PEC数/观察的PEC数1000,实训六 小鼠精子畸变试验,一、实训目的精子畸变试验是检测受试化学毒物能否破坏哺乳动物精子正常形态的试验方法，通过本次实验，了解正常精子和畸变精子的形态，掌握精子畸变试验的原理和步骤。,二、实训原理 引起精子畸变的原因很多，畸变的机理也无定论。其中一些理论认为化学物质可能导致精子形成的有关基因发生突变，引起精子畸变率增高。精

26、子的成熟和正常形态发生过程受多种基因控制，当这些基因中的任一个基因在化合物的作用下发生突变，就会导致精子的畸形率增高。某些特殊的染色体重排，如性-常染色体易位，是化合物诱发精子发生畸形率增高的主要机理。但是公认精子畸形率增高，并非必然意味着是受试物诱发突变的结果，某些其他因素，如缺血、变态反应、感染和体温增高等，亦可能导致精子畸形率增高。,三、仪器和材料(一)器材手术剪刀、眼科直头小镊子、大镊子、载玻片、染色缸、晾片板、擦镜纸、干净纱布、吸头滴管、显微镜，离心机、离心管等(二)试剂生理盐水、甲醇、1伊红染液。受试毒物：环磷酰胺或甲基磺酸乙酯。,四、操作方法与步骤(一)试验设计1.动物选择：一般

27、采用68周龄的雄性小鼠。因其较为经济，而且已有许多实验证实，在该实验系统中小鼠最为敏感。每组应保证至少有5只存活动物。2.剂量和分组：受试物至少设3个剂量组，并同时设阳性和阴性对照组。受试物高剂量组的总剂量应能使部分动物死亡，然后以l/5或1/10递减作为中、低剂量组。 阳性对照可给予甲基磺酸乙酯60mg/kg或环磷酰胺20mg/Kg，腹腔注射，每天1次，连续5d。阴性对照使用等体积的溶剂。,(二) 操作步骤 1.染毒和处死：受试物多用腹腔注射。每天一次，连续5天给药。一般在第一次给药后第35天一次处死动物，取样制片。或在给药后每周处死一批动物，连续进行动态观察，直到精子形态恢复正常。 2.制

28、片:（1）颈椎脱臼法或摘眼球取血处死小鼠，取出两侧附辜放入盛有1ml生理盐水的小烧杯中。（2）用眼科剪刀把附睾剪成4小块，静止5-10min，让精子充分游离出来。（3）用吸管尖端吸取精子悬液 ，注意吸取时尽量避开组织碎块。（4）将吸取的精子悬液摘一滴于干净的载玻片上，用吸管轻轻推片。（5）空气干操，甲醇固定10-15分钟，再用1伊红染液染色20分钟，小心用自来水冲洗干净，空气干澡 3.镜检：制好的精子涂片先在低倍镜下找到背静清晰，精子重叠较少的区域，然后用高倍镜按一定顺序检查1000个完整的精子，记录其中畸形精子数及畸形精子类型。,五、结果分析与评价 不同品系小鼠的精子畸形率本底值有较大差异，其影响因素也较多，故实验结果的判断应与相同实验条件下同时进行的阴性对照组比较，且阴性对照组的精子畸形率应与本实验室过去的记录接近。而阳性对照组精子畸形率必须显著高于阴性对照组(P0.01)，否则所得结果不可靠，应重做。,六、注意事项1.如将精子悬液经过滤、离心等步骤除去组织残渣后再推片效果更好。但这将使制片过程复杂化，而且容易造成人为误差。2.不同的诱变剂作用于生精细胞的不同发育阶段，因而在接触不同化合物后畸形精子增多的时间也不同。通常是处于精母细胞阶段的生精细胞对化学诱变剂较敏感，故在接触化合物染毒后35周时精子畸形率最高。若能给予受试物后做动态观察，则有助于全面评价其毒性。,