dgh呼吸系统疾病动物模型2016.ppt

1、中南大学湘雅基础医学院病理生理学系邓恭华,第六章呼吸系统疾病动物模型,一、慢性支气管炎概述,慢性支气管炎(chronic bronchitis)：指由感染或非感染因素引起的气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎性反应。,第一节 慢性支气管炎动物模型,1. 慢性支气管炎的定义：,2. 慢性支气管炎的特点：,2) 咳痰或伴有喘息反复发作，每次持续3个月以上，连续2年以上的慢性病理过程。,3) 严重时可并发肺气肿或肺心病。,4) 初期症状较轻，常在冬季发病，春季转暖后症状缓解。 晚期病性加重，季节性表现不明显，可常年存在。,1) 发病以老年人居多。,3. 慢性支气管炎的病因： 1)吸烟：长期烟

2、民 2)感染：各种病原菌 3)理化因素：刺激性烟雾、毒气、粉尘、二氧化硫气体等。 4)气候因素：寒冷 5)过敏反应 6)呼吸道局部防御及免疫功能降低 7)自主神经功能失调,二、慢性支气管炎造模方法,1. 吸入毒气方法,（一） 吸入单一有毒气体法,2. 吸入SO2法的特点,1)小鼠出现刺激性咳嗽，体重不增，少数死亡。2)支气管病理改变：早期为急性炎症，12天后出现淋巴细胞、浆细胞浸润，继而支气管周围结缔组织增生，27天后显示为重度慢性支气管炎。3)支气管腔内粘液阻塞，气管上皮坏死，杯状细胞和气管平滑肌增生，肺泡腔扩大，部分肺泡融合成肺大泡。,此法还可观察到：气道和肺组织毒蕈碱型受体(M受体)及功

3、能改变。,3. 吸入SO2法的优、缺点和应用,优点： 1)此法稳定可靠，成功率高，为最常用的慢性支气管炎模型； 2)需要观察气道和肺组织毒蕈碱型受体(M受体)及功能改变的，吸入SO2法最好。,缺点： 1)此法需要每天检测SO2浓度，所需设备和操作复杂，耗时费力。 2) SO2为有害气体，吸入后动物发生严重气道内病变，常导致动物死亡。,应用：最常用的慢性支气管炎动物模型,1. 吸入烟雾方法,（二） 吸入烟雾法,2. 吸入烟雾法的特点,1)随着吸入烟雾时间延长，气管炎病变逐渐加重，至第7周形成慢性支气管炎典型改变。2)气管炎症细胞特点：初期以巨噬细胞为主，随后以淋巴细胞为主，中性粒细胞仅在接触烟雾

4、的早期短时间内升高。,3. 吸入烟雾法的优、缺点和应用,优点： 1)此法简单易行，合并出现其它疾病情况少。 2)此法起病较缓，可以反映慢性支气管炎早期炎症形成的系列过程。,缺点： 烟雾吸入(烟熏)法需要较长时间，考验耐心。,应用： 特别适用于研究慢性支气管炎发生发展过程中需要探讨不同阶段的病理变化及相应的炎症细胞的浸润、炎性标志物的变化。,1. 病菌滴鼻的方法,（三） 病菌滴鼻法,2. 病菌滴鼻法的特点,1)更接近于临床实际情况2)感染2天后小鼠出现毛松、咳嗽、食欲缺乏等3)感染3-6天后出现气管上皮轻度坏死，杯状细胞数目初期下降， 约10天后逐渐升高4)感染35天后出现典型的慢性支气管炎症状

5、5)感染50天后逐渐恢复正常,3. 病菌滴鼻法的优、缺点和应用,优点： 1) 由于采用病原菌摸拟临床感染状况，故更接近临床实际情况 2)由于呼吸道感染病源菌众多，故采用最合适的病菌滴鼻，对探讨不同病源菌导致慢性支气管炎的发病机制有很的应用价值。,缺点： 1) 致病菌混合的制备有一定难度 2) 不同致病菌引起的慢性支气管炎有较大差异 2) 可能导致研究人员的感染,应用：主要适用于探讨慢性支气管炎病因（不同致病菌）、诱因，以及要求模拟临床实际情况的实验研究,1. 气管内滴注内毒素的方法,1）将大鼠用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉；2）仰卧位固定，拉出舌体，暴露声门，快速将套管穿过声门，插入气管；3）将

6、内毒素（浓度200g/ 200l）注入气管；4）大鼠饲养34周后，逐渐出现慢性支气管炎表现。,此法由于要做全麻手术和气管插管，比较麻烦，对大鼠损伤也大。,（四） 气管内滴注内毒素法,2. 气管内滴注内毒素法的特点,1)用毒素代替致病菌，克服了致病菌混合液难制备的问题2)气管滴注脂多糖(LPS)约21天后，小鼠出现倦怠、毛发失泽、进食和饮水均减少3)支气管病理改变：气管、支气管上皮脱落，杯状细胞及粘液腺细胞增生，慢性炎症细胞浸润，平滑肌细胞增生肥大，管壁增厚4)支气管腔内充满粘液及大量中性粒细胞,3.气管内滴注内毒素法的优、缺点和应用,优点： 1) 克服了致病菌混合液难制备的问题 2) 避免了导

7、致研究人员感染病菌的风险 3) 不需要象SO2吸入法那样，天天测SO2浓度,缺点： 1) 当滴注LPS过量时，可能会导致内毒素血症，引起急性肺损伤。这与复制慢性支气管炎疾病模型思路相冲突 2)不象致病菌滴鼻法那样贴近临床，已经与临床实际情况有较大差异 3) 需要做全麻手术和气管插管，比较麻烦，对大鼠损伤也大,应用：适用于嫌病致菌制备难，天天测SO2麻烦，专注于慢性支气管炎发生发展机制研究,例一、构建熏烟致慢性支气管炎小鼠模型,结 论,一、支气管哮喘概述,支气管哮喘(bronchial asthma)：指由于某些过敏因素引起的以支气管阻塞为特点的疾病。,1. 支气管哮喘的定义：,2. 哮喘的特征

8、：阵发性带有哮鸣音的呼吸困难、咳嗽、咳痰，且反复发作。一般春、秋二季发病率较高，20%患者有家族史。,第二节 支气管哮喘动物模型,3. 支气管哮喘的危险因素：,1) 吸入性过敏原：花粉、真菌；尘螨、动物毛发及排泄物等 2) 食入性过敏原：鱼虾等水产、海产品；牛奶、鸡蛋、花生等 3) 呼吸道感染 4) 药物 5) 工业粉尘、化学气体或蒸气 6) 冷空气、过度通气、运动 7) 强烈情绪变化,4.支气管哮喘发作的时相：,患者在接触过敏原后几分钟内，出现哮喘发作的症状，最大呼气流速显著降低，一般持续23小时后即可恢复，称为哮喘的速发相反应。其机制与型变态反应有关。 有一部分病人在速发相之后紧接着出现第

9、二次哮喘发作，症状更重，持续时间更长，可达10小时甚至几天，重症者持续几十天，称为迟发相反应。其机制与气道过敏性炎症有关。,过敏性哮喘的临床过程可分为速发相反应和迟发相反应两个阶段。,病人可发生双相反应，也可只发生速发相或迟发相反应。儿童哮喘的迟发相反应要比成人多。,二、支气管哮喘造模方法,（一） 致敏源诱发的哮喘模型,1. 方法,2.致敏源诱发的哮喘特点,小鼠： 1)常用小鼠品系有：BALB/c品系较易产生气道高反应，并产生高滴度IgE；而C57BL/6品系不易出现气道高反应，且只产生低滴度IgE。,大鼠： 1)常用大鼠品系有：Brown Norway(国外)；Sprague Dawley，

10、Wistar(国内)。 2) 哮喘激发后3-5分钟发生速发相反应，2-4小时发生迟发相反应，随后出现肺部炎症细胞(24小时内主要是嗜酸性细胞)浸润。 3)哮喘发作24小时内气道反应性升高，增幅为7-10倍，持续4-5天。多次激发能延长气道高反应性持续时间。 4)能出现与人类哮喘类似的迟发相反应，并有嗜酸性细胞浸润和气道反应性增加。,豚鼠： 1)很容易致敏，并激发产生型变态反应。 2)激发后的急性气道过敏反应，包括速发相和迟发相哮喘反应。,3.致敏源诱发的哮喘模型优、缺点和应用,优点： 1)卵清蛋白来源容易，且价格低廉。 2)卵清蛋白免疫原性强，容易致敏和激发哮喘。 3)是国内外最常用的哮喘疾病

11、模型。,以下分别列举： 小鼠、大鼠和豚鼠支气管哮喘模型的优点、缺点和应用,优点： 小鼠便宜，价格低，有利于大规模实验。,小鼠哮喘模型优、缺点和应用,缺点： 1)几乎所有暴露于变应原(过敏原)的小鼠都可产生哮喘，故小鼠哮喘模型不宜应用于基因多态性研究。 2)小鼠与人类存在呼吸系统的解剖、生理学上的差异。呼吸频率快，但潮气量低。 3)小鼠与人类还存在免疫学机制上的差异。大多数小鼠哮喘模型会出现过敏性肺泡炎和超敏性肺炎，而掩盖了气道病变。,应用：适用于需要大规模实验的情况，如:评价预防效果或哮喘疗效。,大鼠哮喘模型优、缺点和应用,优点： 1)大鼠品系纯且全，易于繁殖，获得容易。 2)价格较便宜，能减

12、轻研究经费压力。 3)与小鼠相比，可获取的标本量大很多。 4)大鼠生物学特性与人有较多的相似性。,缺点： 1)国际上哮喘研究论文主要采用Brown Norway品系大鼠，但其价格较贵。BN大鼠哮喘模型的主要优势在于能产生针对吸入性变应原的特异性IgE抗体，且更易诱发哮喘症状、明显的气道炎症和气道高反应性。,应用： 1)是最常用的哮喘动物模型之一。 2)适用于皮质激素治疗哮喘作用机理研究，以用非皮质激素类抗哮喘免疫抑制剂的疗效观察和评价。,豚鼠哮喘模型优、缺点和应用,优点： 1)豚鼠价格较便宜；体型较大，方便实验操作；获取标本量大。 2)变应原诱发的支气管哮喘与人类支气管哮喘中的气管收缩特点相同

13、。包括：接触抗原后的支气管收缩反应；气道对介质的高反应性；以及嗜酸性细胞浸润的特征。,缺点： 1)由于近交系豚鼠罕见，不利于用来研究遗传因素的影响。 2)皮质激素对豚鼠哮喘模型的支气管痉挛影响不显著。 3)可能出现种群依赖性的夸大反应，如：过敏性休克，导致豚鼠死亡。,应用： 1)是使用最广泛的变应原性支气管哮喘模型。 2)致敏性豚鼠的过敏性支气管收缩(包括速发相和迟发相)在研究抗过敏药、支气管扩张药药物疗效方面就用非常广泛。,（二） 甲苯二异氰酸甲酯(TDI)诱发的职业性哮喘模型,1. TDI诱发哮喘方法,2. TDI诱发哮喘特点,1)经TDI/BSA激发后，动物呼吸频率加快、幅度增大，哮喘时

14、伴有咳嗽、躁动不安，甚至出现痉挛性呼吸。2)85%动物可同时出现不同滴度的抗原特异性IgE、IgG抗体。3)TDI是重要的职业性致哮喘化学品之一。,3. TDI诱发哮喘优点、缺点和应用,优点： 是TDI致职业性哮喘的重要动物模型。从事TDI作业者中约有5%-10%的人可发生职业性哮喘。缺点： 1)TDI/BSA抗原制备难度大，步骤繁锁。 2)属职业性哮喘，应用范围窄。应用：适用于TDI职业性哮喘方面研究。,（三） 邻苯二甲酸酐(PA)诱发的哮喘模型,1. PA诱发哮喘模型方法,2. PA诱发哮喘模型的特点,1) 苯酐(PA)为固体化学品，也可引起哮喘。为什么？2)雾化吸入激发后1-10分钟，动

15、物呼吸频率加快(由100-120次/分，上升至140-160次/分)，幅度增大，伴咳嗽、喷嚏，重症者呼吸费力，挣扎，可有暂窒息或死亡。,苯酐,3. PA诱发哮喘模型的优点、缺点和应用,优点： PA是重要白色固体化工原料，也是一种常见的职业性致哮喘物质。,缺点： 与TDI至哮喘一样，属职业性哮喘，应用范围窄。,应用：适用于PA所致职业性哮喘方面研究,例二、卵清蛋白诱导小鼠建立支气管哮喘模型,结 论,一、肺心病概述,1. 肺心病的定义：,肺心病是指由慢性支气管炎、肺气肿和肺纤维化，以及肺血管病变而引起的心脏病。,2. 肺心病的病理特点：,1)肺动脉高压；2)右心室肥大和右心衰竭。,第三节 肺心病动

16、物模型,二、肺心病造模方法,（一） 肺循环高压模型,肺循环高压：指包括肺动脉高压、肺静脉高压和混合性肺动脉高压的总称。,肺动脉高压：指肺动脉压增高，而肺静脉压正常。也称为动脉型肺动脉高压。,特发性肺动脉高压：指没有任何原因(包括遗传、病毒、药物)而发生的肺动脉高压。,肺循环高压诊断标准：在海平面静息状态下经右心导管检查 1)肺动脉收缩压30mmHg 2)肺动脉平均压25mmHg 3)运动时，肺动脉平均压30mmHg 以上三项，居其一即可,(1) 方法,1、缺氧型肺循环高压动物模型,动物舱室(250-300升) ： 1)顶部有三通，便于气体样本，检测O2和N2浓度。使O2浓度保持在10%左右，C

17、O2浓度保持在3%以下。 2)底部有一小裂隙，便于舱内、外气体交换，气压相等。 3)舱内CO2用钠石灰吸收，水蒸气用无水氯化钙吸收。 4)舱内有小风扇将通入气体混均。,(2)缺氧型肺循环高压模型的特点,1)动物舱室设计和制作有点难度。2)需要O2分析仪和CO2分析仪，且检测麻烦。3)舱内温度难保持恒定，也难以消除CO2和水蒸气的影响。,(3)缺氧型肺循环高压模型的优点、缺点和应用,优点： 舱室设计，操作简单，能保持舱内长时间低氧状态。如能通过自动化设计，时实动态检测O2和CO2浓度，控制好舱内温度、湿度和气压，将是一个好的造模方法。,缺点： 1)每天检测O2和CO2浓度很烦。 2)通过调节舱室

18、通气量保持O2浓度和气压有难度。,应用：适用于因长期缺氧导致肺循环高压，继发右心肥大，右心衰的肺心病模型。,(1) 方法,2、缺氧型肺循环高压动物模型,(2) 特点,1)肺动脉压升高显著，可达正常值3倍。2)伴右心室肥厚和体重减轻。3)光镜下可见肺血管重塑明显，表现为：血管内膜增生，中层增厚。4)野百合碱可重复诱导产生严重的进展性肺动脉高压。,(2) 优点、缺点和应用,优点： 1)方法简便易行 2)本模型为常压缺氧肺循环高压模型，更类似于平原地区的肺心病发病情况。,缺点： 与缺氧、酸中毒、内毒素导致的肺血管损伤相比，野百合碱属于化学品或药物导致的肺血管损伤。,应用：适用于常压缺氧肺循环高压的肺

19、心病方面研究,（二） 慢性阻塞性肺部疾病(COPD)模型,1.方法,动物烟熏箱(202530 cm3) ： 1)烟熏箱的一侧下部留有一个直径为0.5cm的通气管，与箱外侧的不锈钢燃烟室相通。 2)燃烟室进气孔连接一个小电风扇。电扇风力助燃并推动烟雾和O2进入烟熏箱。,香烟：采用市售无过滤嘴的香烟(每支约含焦油25mg，烟气烟碱量1.4mg),(2) COPD模型特点,1)采用香烟烟熏36周以上的方法制备大鼠COPD模型。是一个较长期的慢性实验，更符合人类COPD的临床实际情况。2)多种炎症细胞参与。气道内主要是PMN和M为主，肺细胞内以M (CD68+)和T-淋巴细胞浸润为主。3) 多种炎症因

20、子参与。如：IFN、MCP-1、ET-1、IL-2，4，6，10等。4)气道高分泌，炎症细胞增多，管壁增厚，胶原等细胞外基质增多并过度沉积、纤维化(COPD气道重塑的重要病理改变)。,(2) COPD模型的优点、缺点和应用,优点： 1)方法简便易行，不需要贵重仪器设备和药品。 2)属较长期的慢性实验，因此更符合人类COPD的临床实际情况。,缺点： 1)长期的慢性实验，考验的是人的耐心、恒心和毅力。 2)能否导致继发性肺心病，还需要更长的烟熏时间和耐心等待。,应用：适用于COPD病理、病生及药物疗效方面的研究,例三、低氧性肺动脉高压大鼠模型的建立,结 论,本研究结果提示肺动脉高压的大鼠模型成功建

21、立。,本研究模型的建立较好地模拟了 患者肺动脉高压发生的病理过程，可以应用于 患者的临床研究。,陈丽英等 低氧性肺动脉高压大鼠模型的建立中华危重症医学杂志 2015，vol. 8 (5): 312-314,一、肺栓塞概述,肺栓塞的定义：,肺栓塞：指以各种栓子阻塞肺动脉系统为其发病原因的一组疾病或临床综合征的总称。包括：血栓、脂肪、羊水、胎粪、空气等栓子。,肺血栓栓塞：是指来自静脉系统或右心的血栓栓子阻塞肺动脉或其分支所致肺部疾病。主要表现为：肺循环障碍和呼吸功能障碍。,急性肺血栓栓塞导致较为广泛肺动脉阻塞时，可引起肺动脉高压，甚至发生急性肺源性心脏病。而缺血区可能发生肺梗死。由于肺组织多重供血

22、、供氧机制，只有大约15%患者发生肺梗死。,第四节 肺栓塞动物模型,二、肺栓塞造模方法,（一） 血栓栓塞法,1. 方法,2.血栓栓塞法模型的特点：,家兔血栓栓塞法： 1)家兔体型适中，价格不高，性格温顺，插管较方便。 2)与其它动物相比，家兔的纤溶系统与人类的更接近。故，本模型是最普遍、最成熟的肺血栓栓塞模型。,犬血栓栓塞法： 1)犬体型大，血管粗，插管手术操作非常方便。 2)犬血量大，多次抽血样也不易发生低血容量的情况 。,3.血栓栓塞法模型的优点、缺点和应用：,优点： 兔血栓栓塞法模型是最普遍、最成熟的肺血栓栓塞模型。因为与其它动物相比，家兔的纤溶系统与人类的更接近。,缺点： 1)本法的血

23、栓主要是在体外形成，与临床上肺血栓栓塞时，体内处于高凝状态不一样。 2)用犬做实验，有被咬伤或感染狂犬病的可能。,应用： 1)兔模型适用性广，是最常用的肺血栓栓塞模型。 2)犬模型更适用于取样量多、需要动态观察的肺栓塞实验研究。,（一） 药物注射法,1. 方法,2.药物注射法模型的特点：,1)药物注射法致肺血栓栓塞，简单快捷，方法可靠，稳定性好。2)利用药物在体内形成静脉血栓，然后导致肺栓塞，比栓子栓塞法更符合临床实际情况。,3.药物注射法模型的优点、缺点和应用：,优点： 此方法简单快捷，可靠性和稳定性好。,缺点： 血小板血栓栓子较小，难以摸拟人肺内大血管栓塞情况。,应用： 1)小鼠肺栓塞模型

24、，适合需要大规模样体的实验研究。 2)兔和犬肺栓塞模型，适合需要多次采样、动态观察指标变化的实验研究。,目的 通过建立操作简便、成功率高、使用经济的急性肺血栓栓塞大鼠动物模型,掌握自体肺血栓栓塞动物模型的制备,检测自体肺血栓栓塞的持久性。,例四、大鼠自体肺血栓栓塞模型的成功制备,二、方法,本实验研究发现：大鼠自血栓注入后并没有表现持续的肺动脉压升高或氧分压降低,因为大鼠具有极高的纤溶能力,所以自体血栓不能产生一个持久固定的肺栓塞模型。,结 论,因此与临床肺血栓栓塞的病理生理过程更符的、持久固定血栓模型的研究应成为今后肺栓塞动物模型的主要研究方向。,冯伟等 大鼠自体肺血栓栓塞模型的成功制备临床肺

25、科杂志 2015年5月 第20卷第5期：785-788,the end,谢谢！,混合烟雾制烟方法：,1. 配方：锯末200g，烟叶15-20g，辣椒6-7g，硫黄1g。,2. 点燃后，在20-30分钟燃化，混合烟雾含尘量 150-200mg/m3，颗粒大小0.5-1.0m以上。,香烟烟雾制烟方法：,1. 用香烟1.5支，在21L容器中燃化，豚鼠吸气10分钟。2. 换气5分钟。3. 用香烟1支，再次燃化，豚鼠再吸气10分钟。,流感病菌菌液制作方法：,1. 接种流感病毒后， 37 培育48小时的鸡胚液，病毒液血凝滴度为1：320。接种流感杆菌后， 37 培养18-24小时，收集菌液备用。在滴鼻使用

26、前，将菌液中流感杆菌的浓度稀释为7108个/ml 。,混合细菌菌液制作方法：,1. 流感杆菌，9 108个/ml 。甲型链球菌，6108个/ml 。卡他性炎性菌， 9108个/ml 。肺炎双球菌， 6108个/ml 。将上述4种菌液以4：3：2：1的比例混合，备用。,1. 溶液：卵清蛋白1000 g/ml2. 溶液：氢氧化铝10 mg/ml3. 将溶液与溶液以1：1的比例混合。注意混合液要新鲜配制,1号卵清蛋白抗原液配制方法：,2号卵清蛋白抗原液配制方法：,1. 溶液：卵清蛋白300 mg/ml2. 溶液：灭活百日咳杆菌疫苗15109个/ml3. 溶液：氢氧化铝300 mg/ml4. 将溶液、

27、和，以1：1：1的比例混合。注意混合液要新鲜配制,TDI-BSA抗原制备：,1. 溶液A：1%TDI/1,4-二氧六环液2. 溶液B：1%BSA/碳酸氢钠溶液3. 将溶液B置于冰水浴中，开磁力搅拌，逐滴加入溶液A，调节该溶液的pH值至8.5。4. 1小时后移至透析袋中过夜，使1,4-二氧六环挥发。5. 在pH为7.4的PBS中彻底透析6次，使溶液在紫外分光光度计245nm处有高吸收峰。,6. 将制备成的上述抗原，加卡介苗、费氏完全佐剂混合，用乳钵研磨成油包水乳剂备用。,PA-BSA抗原制备：,1. 溶液A：PA丙酮溶液(30mgPA溶解于1ml丙酮中)。2. 溶液B：2%BSA/碳酸氢钠溶液(

28、9%)。3. 将溶液B置于冰水浴(4)中，开磁力搅拌器，搅拌1小时。4. 将制备好的PA-BSA抗原与弗氏完全佐剂1：1混合，乳钵中研磨，形成油包水乳剂备用。,PA-HSA抗原制备：,1. 溶液A：PA丙酮溶液(30mgPA溶解于1ml丙酮中)。2. 溶液B：2%HSA/碳酸氢钠溶液(9%)。3. 将溶液B置于冰水浴(4)中，开磁力搅拌器，搅拌1小时。4. 将制备好的PA-HSA抗原与弗氏完全佐剂1：1混合，乳钵中研磨，形成油包水乳剂备用。,胶原和肾上腺素混合液制备：,1. 胶原溶液：200 g/ml2. 肾上腺素溶液：100 g/ml3. 将以上两种溶液以1：1比例混合、摇匀。,以下是附录1-5,常用药物的最大给药量,人及不同实验动物之间药物量对应值,例如：某药物在60kg体重的病人的剂量为21.0g.kg-1 . d-1，一只5kg的猴为53.6 g.kg-1 . d-1，一只10kg重的犬为40.4 g.kg-1 . d-1 ，一只20g的小鼠则为260.6 g.kg-1 . d-1 。,常用实验动物的最大安全采血量与最小致死采血量,常用麻醉剂的用法及剂量,